Cistanche:Echinacoside Suppresses Pancreatic Adenocarcinoma Cell Kwasans pa Inducing Apoptosis Atravè Mitogen-aktive Protein Kinase Pathway

Kontak: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG AK XINFENG LI

Abstrè.

Aplikasyon klinik la nan pwodwi natirèl sòti nan medikaman tradisyonèl Chinwa te pran atansyon nan kansè nan chimyoterapi.Echinacoside(ECH), youn nan fenomèn yo, izole soti nan tij yo nanSispann(yon medikaman èrbal Chinwa) gen efè tisi-pwoteksyon ak anti-apoptotik sou sistèm santral la nève. Sepandan, li rete lajman efikas si wi ou non ECH posede aktivite timè-sipresif. Nan etid la prezan, li te demontre ke ECH ka make anpeche pwopagasyon an nan selil adenocarcinoma pa pwodiksyon an nan espès oksijèn reyaktif ak pèt la nan potansyèl mitokondrial potansyèl e konsa deklanche aparèy. Anplis de sa, li te elimine ke ECH(Echinacoside)represyone kwasans selil timè nan modile aktivite MAPK. An konklizyon, etid sa a revele yon fonksyon roman nan ECHEchinacoside) nan anpeche devlopman kansè, ak implique ke l 'nan ECH ta ka yon estrateji potansyèl chimyoterapi pou kansè.

Entodiksyon

Chemen an sipremorasyon timè p53 atravè endiksyon an nan sipremors timè a, ARF bese oncogenic E3-ligase sourit doub minit (MDM) 2-medyatè p53 degradasyon (3). Sa a se yon mekanis oto-réglementées, mekanis pwòp tèt ou-pwoteksyon ki anpeche selil ki soti nan transfòmasyon malveyan. Nòmalman, p53 ka reprimande aktivite mwen an pa aktive transkripsyonèl, pou egzanp, miR-145 ki vizeMycARNA pou tradiksyon peche (4,5), konsa fòme yon bouk regilasyon fidbak negatif.

Estrateji ki pi dwat ak efikas pou trete kansè se touye selil kansè yo. Souvan yo itilize dwòg antikansye, tankou cisplatin (6), actinomycin D (7), ak adriamycin (8) yo montre yo anpeche kwasans timè pa fè pwomosyon apostosis. Dènyèman, ap grandi prèv te demontre ke yon kantite pwodwi natirèl ak dérivés soti nan plant yo, patikilyèman nan plant medsin yo itilize nan medikaman tradisyonèl Chinwa (TCM), montre yon fonksyon timè-sipresif pa pwovoke aparèy la nan selil kansè epi yo gen potansyèl la pou aplikasyon pou kansè nan terapi kansè (9). Pou egzanp, emodin natirèl la izole soti nan anpil kalite selil kansè (10,11). Camptothecin, sòti nan pyebwa Chinwa a 'pyebwa kè kontan',Kantotheca egzamine, se yon pwodwi natirèl ki anpeche ligati ADN nan apre topo I-medyatè repo (12). Nan yon lòt etid retrospektiv ki baze sou kowòdone nan yon total de 729 pasyan ki gen kansè nan tete avanse, li te sijere ke terapi TCM ka kontribye nan tretman kansè. Nan kòwòt sa a, 115 pasyan yo te itilizatè TCM pandan y ap 614 pasyan pa t 'sèvi ak TCM. Analiz la miltivariate demontre ke, konpare ak ki pa itilizatè yo, itilize nan TCM te asosye ak yon risk siyifikativman diminye risk pou tout-kòz mòtalite (13). Tout rezilta yo simansyone endike ke TCM se yon medikaman enpòtan ak altènatif ki ka itilize nan tretman kansè.

sou lapawòl ak blesi poumon egi (16,17). Epitou, ECH(Echinacoside)yo te montre yo gen efè pwoteksyon sou tisi nè ak amelyore maladi konpòtman nan modèl min nan maladi Parkinson la (18). Nòmalman, li te jwenn ke ECH ankouraje pwopagasyon selil ak anpeche apoptosis nan sourit la sourit entesten mode-K selil (19). Se konsa, lwen, sepandan, mwens atansyon te peye nan wòl potansyèl ECH nan prevansyon kansè.

Nan etid sa a, li te eksplore si tretman ECH afekte kwasans selil timè ak pwopagasyon ak si wi ou non ECH(Echinacoside)induit apoptosis, elve pwodiksyon an nan espès oksijèn reyaktif (ROS) ak diminye potansyèl mitokondrial len (MMP), ak konsekans siprime kwasans selil timè. Anplis de sa, etid la prezan ki vize idantifye mekanis yo molekilè ki responsab pou ECH-medyatè anpèchman kwasans selil.

Materyèl E metòd yo

Sèlil Liy Reyaktif E antikò.SW1990 pankreyas adenocarcinoma (ATCC, Manassas, VA, USA) yo te kiltire nan modifye mwayen Eagle modifye Eagle sipleman ak 10% serom bovine fetal, 50 U / ml penisilin ak 0.1 mg / ml streptomycin nan 37 °C nan yon 5% co2 imidite atmosfè. ECHANJ(Echinacoside)te achte nan Jrdun Biyoteknoloji Kòporasyon (Shanghai, Lachin). Antikò kont AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38, ak GAPDH yo te achte nan Teknoloji Siyal Selilè (Danvers, MA, USA); Anti-Bax ak anti-Bcl-2 yo te achte nan Santa Cruz Biyoteknoloji Inc. (Santa Cruz, CA, USA); ak anti-Kapasite-3 te achte nan Abcam (Shanghai, Lachin).

Sèlil vizibiliteEsè. Pou evalye pousantaj kwasans selil timè, Selil Konte twous-8 (CCK-8; Dojindo Molekilè Teknoloji, Rockville, MD, USA) te itilize selon enstriksyon manifakti a. Sispansyon selil yo te grenn nan 5,000 selil pou chak byen ak Tretman ECH pou 0, 12, 24, 48 oswa 72 h nan plak kilti 96 -byen. Anplwaye kwasans selil te detèmine pa ajoute WST-8 reyaksyon soti nan twous CCK-8 nan yon konsantrasyon final nan 10% nan chak byen, ak absòbe a nan echantiyon yo te mezire nan 450 nm lè l sèvi avèk yon lektè microplate (Multiskan MK3; Thermo Fisher Syantifik, Inc., Waltham, MA, USA).

Hoechst 33342 tach.Selil yo (60% konfli) yo te trete ak Hoechst 33342 (Enstiti Beyotime nan Biyoteknoloji, Ayiti, Lachin) nan yon konsantrasyon final de 1µg / ml, ki enkyete nan 37 ° C enkibatè pou 15 min, lave ak fosfat-afebli saline de fwa, fiks nan 4% paraformaldehyde pou 30 min nan tanperati chanm, ak monte sou glise. Chanjman mòfolojik nan nikleyè selil yo te obsève anba yon mikwoskòp fliyò (Olympus BX51, Melville, NY, USA). Nòmal nikleyè a te wonn ak tache ble limyè, pandan y ap nikleyè a apoptotic te retresi ak tache ble.

Fluorescence-aktive sèlil triyay (FACS) analis yo.Pou evalyasyon an nan apoptosis, izothiocyanate a fluorescein (FITC)-Annexin V Apoptosis twous Deteksyon (BD Biyosciences, Shanghai, Lachin) te itilize dapre enstriksyon manifakti a. Yon ti tan, 5x104 selil yo te lave ak pbs glas-frèt, reyisi nan 0.1 mililit tanpon (Beyotime Enstiti nan Biyoteknoloji), ak tache ak 10 ml nan FITC-konjige Annexin V (10 mg / ml) ak 10 ml propidyòm iodide (PI) (50 mg / ml). Apre enkubasyon pou 15 min nan tanperati chanm nan fènwa a ak adisyon a nan 400 ml obligatwa tanpon, selil yo te analize pa yon sitetè koule (C6; BD Biyosciences, Shanghai, Lachin).

Mezi de eyaktif Oksijèn espès yo (ROS).Pou evalye pwodiksyon an nan ROS, twous Oksijèn Reyaktif Assay (Vigor Biotechnology, Beijing, Lachin) te itilize dapre enstriksyon manifakti a. Yon ti tan, selil yo (80% konfli) yo te rekòlte ak lave ak PBS anvan yo tache ak didroethium la (DHE) solisyon (Beyotime Enstiti nan Biyoteknoloji). Selil yo te Lè sa a, analize pa analiz sikometrik koule.

Mezi de ipòtan len potansyèl (MMP).

Yon teknoloji methylrhodamine methyl ester (TMRM) Assay teknoloji (Immuno Chimi teknoloji, Bloomington, MN, USA) te itilize pou detekte chanjman ki fèt nan MMP. Yon ti tan, selil yo (80% konfli) yo te rekòlte, lave ak PBS ak tach ak TMRM pou 15-20 min nan yon enkibatè 37 ° C. Selil yo te Lè sa a, lave yon fwa ak PBS ak sibi koule analiz klimatrik.

Imunoblottinganalis yo. Selil yo (80% konfli) yo te rekòlte ak bay manti nan tanpon RIPA (Jrdun Biotechnology) ki gen ladan 50 mM Tris-HCL, pH 7.4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% sodyòm deoksicholik asid ak 0.1% SDS ak frèch te ajoute inibitè pwoteyin. Kantite egal nan selil klè yo te itilize pou analiz iminoblotting jan sa dekri deja (20).

Estatistik Analiz.Done Quantitative yo eksprime kòm devyasyon estanda ±. Diferans estatistik yo te evalye pa tès elèv ki poko pa nesesè lè l sèvi avèk estatistik SPSS 15.0 lojisyèl. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Rezilta

ECHANJ (Echinacoside)siprime timè sèlilkwasans. Malgre ke li te rapòte ke ECH(Echinacoside)ekspoze yon wòl pwoteksyon pa anpeche apoptosis ak siyal enflamatwa nan selil somatik, tankou selil ewonn ak entesten epidemi (16-19), li rete efikas si wi ou non kontwòl selil ECH kansè ak pwopagasyon. Pou teste sa a, yon adolesan selil te fèt pa trete selil SW1990, sòti nan yon klas II pankreya adenocarcinoma, ak dòz titre nan ECH jan yo montre nan Fig 1. Notably, li te demontre ke ECH siyifikativman rekonpanse pwopagasyon selil timè nan yon fason dòz-depandan pandan yon peryòd kilti 5-jou (Fig 1).ECHANJ deklancheab osinon. Kòm pèt nan apoptosis se youn nan mekanis yo pi gwo kozatif kache pwopagasyon san kontwòl nan selil kansè nan pankreyas (21), etid la prezan fè yon seri eksperyans yo detèmine si ECH deklanche aparèy. Premyèman, pa tach nwayo a nan selil timè ak Hoechst 33342, li te demontre ke rezilta ECH nan apoptosis nan yon fason dòz-depandan (Fig. 2A). Anplis de sa, facs analiz te fèt lè l sèvi avèk Annexin V / PI tach pi lwen konfime efè a apoptotik nan ti ECH (Fig. 2B). Pousantaj mwayèn nan selil apoptotik yo te 1.1% anba kondisyon kilti nòmal, pandan y ap pousantaj sa a siyifikativman ogmante a 10.6, 21.4 ak 51.3% an repons a tretman ECH nan yon fason dòz-depandan (Fig. 2C). Rezilta sa yo, ansanm ak azi vizibilite selil yo montre nan Fig 1, demontre ke Tretman ECH siprime pwopagasyon selil timè pa deklanche apoptosis.

jenere etyodium ki entèkomine ak ADN, yo te itilize nan etid sa a pou evalye pwodiksyon ROS. Li te jwenn ke, tankou lòt dwòg antikans, ECH tou ankouraje pwodiksyon ROS nan yon fason dòz-depandan jan yo montre pa entansite a fliyoresans elve sou tretman ECH (Fig. 3).

ECHANJ (Echinacoside)redui MMP.Malfonksyònman mitolojik yo te montre yo dwe enplike nan endiksyon an nan apoptosis. Ouvèti nan potansyèl la mitochondrial pèmeyabilite te demontre yo pwovoke depo a nan potansyèl la transmembran ak liberasyon an nan faktè pro-apoptotic (23). Se poutèt sa, li te teste si ECH te kapab pwovoke pèt nan MMP nan selil timè pa fè yon redaksyon TMRM, ki se yon apwòch ki byen etabli, kòm entansite a nan fluoresans TMRM se pwopòsyonèl ak potansyèl len. Li te demontre ke Tretman ECH siyifikativman diminye MMP nan yon fason dòz-depandan (Fig 4).ECHANJ kontwòl yo timè sèlil ogmantasyon atravè protines mitogenbaz molekilè nan lanmò selil ECH-medyatè, aktivite a nan plizyè chemen siyal enpòtan, tankou MAPK ak AKT (24,25), ki kontwole siviv selil ak lanmò te egzamine. MAPK yo se evolisyonè konsève, pwoteyin ki dirije Ser / Thr pwoteyin kinse, ki gen ladan kinase siyal ekstrawòdinè (ERKs), c-Jun NH2-tèminal kinase (JNKs) ak manm fanmi p38 yo ki aktive nan twa-niveau siyal kaskad (26,27). Nan etid sa a, ekspresyon an nan MAPKs ak AKT, osi byen ke fòm fosfò aktive yo, te evalye epi li te revele ke ECH make siprime JNK ak ERK1/2 aktivite, men amelyore aktivite p38 (Fig 5). Nòmalman, li te demontre ke aktivite AKT, ki se tou enpòtan anpil pou pwopagasyon selil, pa afekte pa tretman ECH (Fig 5). Anplis de sa, li te montre ke Tretman ECH elve ekspresyon an nan Bax ak Kapase-3 pandan y ap diminye Bcl-2 ekspresyon (Fig 5), ki konsistan avèk Fig. 2. Se konsa, rezilta yo endike ke ECH deklanche timè selil timè atravè chemen an MAPK.

Diskisyon

Pou pi bon nan konesans nou an, sa a se premye etid la yo montre ke ECH gen yon fonksyon timè-sipresif pa deklanche apoptosis (Fig 2), pwomosyon ROS pwodiksyon (Fig 3) ak pwovoke depo mitolojik potansyèl (Fig. 4), kidonk ki mennen nan timè kwasans selil (Fig. 1). Anplis de sa, baz molekilè nan lanmò selil ECH-medyatè yo te montre yo rive pa kontwole chemen siyal MAPK (Fig. 5). Rezilta sa yo demontre yon fonksyon roman nan ECH nan anpeche timè e konsa sijere ke li ka yon ajan kandida pou terapi kansè.

Majorite nan medikaman antikansye ka pwovoke aparèy selil timè, sans ak / oswa arestasyon sik selilè, ki mennen nan anpèchman nan kwasans selil timè ak pwopagasyon. Arestasyon selilè se yon repons selilè pou siyal estrès twò grav ki pèmèt selil ki domaje ADN ki domaje anvan yo initilize ADN replike oswa mitoz, Lè nou rete apoptosis ak sans (arestasyon selil pèmanan) rive an repons a siyal estrès ki elimine selil ireparab oswa malnignant (28,29). Se poutèt sa, sèlman efè a apoptotic nan ECH sou selil timè yo te evalye nan etid sa a, kòm touye selil kansè se yon gwo kritè pou evalye potansyèl la nan yon ajan antikans. Nòmalman, li te demontre ke ECH pwovoke ekspresyon an nanBax(Fig 5), yon jenetik pro-apoptotic, transkripsyonèlman aktive pa timè a siprime p53 (30). Se konsa, li entérésan si ECH ka aktive chemen an p53 siyal. Si se konsa, ECH kapab tou elit p53-depandan arestasyon sik selil, sans, apoptosis oswa otopousi. Nan etid sa a, fonksyon an timè-sipresif nan ECH nan liy pankreyas SW1990 la adenocarcinoma liy selil te elimine. Sepandan, plis etid obsève plis liy selil kansè, yo obligatwa. Li te montre ke mitasyon nan RAS la pwoteyin onkojèn ak sipremorasyon timè a P53 yo asosye ak devlopman nan kansè nan pankreya (31); sepandan, liy selil SW1990 la pa pò okenn mitasyon p53, dapre baz done a IARC p53 (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Pakonsekan, li enpòtan pou mennen ankèt sou si ECH ka afekte kwasans lan ak pwopagasyon lòt liy selil kansè pankreya ak mitasyon diferan p53. Anplis de sa, li ta enteresan detèmine si ECH se kapab ankouraje aparèy ak anpeche kwasans lan nan lòt kalite timè.

ROS elevasyon ak rediksyon MMP, ki te koze pa Tretman ECH, yo te montre yo dwe esansyèl nan endiksyon apoptosis (22). Anplis de sa, li te jwenn ke ROS ka pwovoke oksidasyon an nan porès la mitochondrial kontribye nan liberasyon an nan cytochromec, yon entèmedyè nan apoptosis, akòz dezòd nan MMP la (22). Se konsa, li rete yo dwe detèmine si ECH deranje MMP endirèkteman nan endiksyon an nan ROS. Anplis, ROS-elit estrès oksidantal te montre tou yo dwe patisipe nan modile yon myriad nan siyal selil-kwasans, ki gen ladan p53, NF-κB, HIFs ak PI3K (32). Li rete yo dwe detèmine si wi ou non, epi, si se konsa, ki jan ECH kontwole chemen siyal enpòtan sa yo. Nòmalman, estrès oksidantal lakòz divès kalite maladi nerodegenerative akòz konsomasyon an oksijèn segondè, sistèm antioksidan fèb ak karakteristik tèminal-diferansyasyon nan sistèm nè santral la (33). Sepandan, plizyè etid yo te montre ke ECH gen efè pwoteksyon ak anti-apoptotik sou tisi nève. Nan sans sa a, li rezonab pou ipotèz ke ECH ka diminye pwodiksyon ROS nan selil yo tèminal ki diferansye neral. Se poutèt sa, li tou rete yo dwe detèmine si règleman an nan pwodiksyon ROS pa ECH se depann sou estati a diferansyasyon selil. Pakonsekan, rezilta yo prezan ansanm ak lòt etid revele ke ECH, lajman itilize TCM, ka yon estrateji chimyoterapi enpòtan pa sèlman pou tretman an nan maladi neurodegenerative, men tou, kasiken malniyan.

Dènyèman, lè l sèvi avèk TCM nan terapi kansè te vin de pli zan pli plis atansyon. Potansyèl la nan pwodwi natirèl ki soti nan plant medsin yo itilize nan TCM te rekonèt pa kominote a syantifik menm nan mond lwès la (9). Efò yo oblije elimine mekanis yo kache nan aksyon nan pwodwi sa yo natirèl, ki ka evantyèlman mennen nan devlopman nan medikaman efikas ak san danje pou terapi kansè.

An konklizyon, etid la prezan demontre fonksyon an timè nan ECH ak tou elabore baz molekilè nan ECH-medyatè sipresyon timè, konsa sijere aplikasyon an potansyèl nan kansè nan ECH nan terapi kansè.

Rekonesans

Etid sa a te finanse ak sipòte pa Pwogram kle nan Rechèch Syantifik nan FMU (sibvansyon no 09ZD014). Otè yo ta renmen remèsye Byomedworld (Shanghai, Lachin) pou èd ak koreksyon maniskri a.

Referans

1. Hanahan D ak Weinberg RA: Hallmarks nan kansè: pwochen jenerasyon an. Selil 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Transkripsyon: Efè transkripsyonèl MYC. Nat Rev kansè 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ ak Roussel MF: Myc siyal atravè ARF sipresyon kontwole p53-depandan apoptosis ak imòtalizasyon. Jenèz Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K ak Mo Y: p53 reprime c-Myc nan endiksyon nan sipresyon timè a MiR-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X ak Lu H: Nouvo insight nan fonksyon p53 nan microRNas sib li yo. J Mol Biol Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB ak Lippard SJ: Cisplatin ak ADN reparasyon nan chimyoterapi kansè. Tandans Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H ak Korc M: Actinomycin D pwovoke apoptosis ak anpeche kwasans lan nan selil kansè pankreya. Int J Kansè 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P ak Das CR: Doksin: Yon ajou sou aksyon molekilè antikans, toksisite ak sistèm livrezon dwòg woman. J Pharm Famasyen 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS ak Kaina B: Soti nan medikaman tradisyonèl Chinwa nan terapi rasyonèl. Tandans Mol Med 13: 353-361, 2007.