Phenylethanol Glycosides Soti nan Cistanche Tubulosa Siprime Aktivasyon Selil Epatik Stellate ak Bloke Kondiksyon an nan chemen siyal nan TGF -01/smad kòm potansyèl ajan anti-epatik fibwoz.
Mar 05, 2022
Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping Ou, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang ak Tao Liu
Résumé: Cistanche tubulosase yon medikaman tradisyonèl Chinwa èrbal lajman ki itilize pou reglemante iminite akglikozid feniletanoid(CPhGs) se yo ki pami eleman prensipal ki responsab aktivite sa a. Etid anvan yo te endike efè prevantif ak terapetik CPhG yo sou fibwoz epatik bovine serum albumin (BSA)-induit nan rat. Objektif etid la se te evalye efè fibwoz epatik CPhG ak monomè yo.echinacosideepiacteosidepa anpeche activation selil epatik stellate (HSC), bloke kondiksyon chemen siyal nan transfòmasyon faktè kwasans-p1 (TGF-p1) / smad, epi detèminen yo ap aktivite epatoprotective in vitro. Pwopagasyon HSC te evidamman inibit apre tretman ak CPhGs (100,50 ^g/mL)/echinacoside (500,250,125 ^g/mL)/acteoside (6, 3 ^g/mL), ak valè IC50 nan 119.125.520.345 ak g/6. mL, respektivman, nan tès MTT la. Diferan konsantrasyon CPhGs/echinacoside/acteosidepa t 'afekte toksisite selilè a sou HSC dapre mezi laktat dehydrogenase (LDH). Diferan konsantrasyon CPhGs/echinacoside/acteosideogmante nivo mRNA ak ekspresyon pwoteyin smad7 ak diminye nivo mRNA smad2, smad3 ak ekspresyon pwoteyin smad2, fosfo-smad2 (p-smad2), smad3, fosfo-smad3 (p-smad3) nan HSC. An rezime, rezilta sa yo demontre ke CPhGs/echinacoside/acteosideka bloke kondiksyon chemen siyal yo nan TGF-p1/smad, epi anpeche aktivasyon HSC, sa ki sijere keC. tubulosaSe konsa, ka yon medikaman èrbal potansyèl pou tretman fibwoz fwa.
Mo kle: Cistanche tubulosa; phenylethanol glikozid soti nanCistanche(CPHGs);echinacoside; acteoside; selil stellate epatik (HSC); TGF-p1/smad
1. Entwodiksyon
vin proliferatif ak fibrogenic, imedyatman akimile ECM, epi finalman diferansye nan selil fibrogenic myofibroblast ki tankou. Transfòmasyon kwasans faktè-.1 (TGF-p 1) konsidere kòm medyatè prensipal profibrogenic la. Chemen siyal ki gen rapò ak TGF-&1 se yon mekanis enpòtan nan fibwoz epatik, epi li sitou gen ladan siyal smad-depandan ak smad-endepandan, epi yo panse chemen transduction siyal smad-depandan an se yon gwo chanèl siyal TGF-p1. . Se poutèt sa, blokaj nan chemen an siyal TGF-p1/smad ka siprime pwodiksyon kolagen an epi evantyèlman soulaje fibwoz epatik, ki te fè chemen sa a yon sib enpòtan nan rechèch dwòg anti-epatik fibwoz nan dènye ane yo.
Malgre gwo ensidans nan fibwoz epatik atravè lemond, pa gen okenn terapi anti-fibrogenic jeneralman aksepte [2-4]. Tradisyonèl Chinwa Medikaman èrbal (TCHMs) yo nan gwo enterè pou tretman maladi fwa paske kèk ka itilize dwòg ki ka geri nan jesyon ak prevansyon fibwoz fwa. Kounye a, anpil etid yo konsantre sou potansyèl dwòg anti-fibrogenic ki te itilize kòm TCHM pou dè milye ane [5].
Cistanche tubulosa W (fanmi Orobanchaceae) yon plant parazit, se lajman grandi nan rejyon sid Xinjiang nan Lachin [6]. Moun yo sèvi ak li pou dinamize ren yo, nouri san an, detann zantray yo ak retade senesans san efè segondè, epi li ofisyèlman nan lis famakope Chinwa a [7]. C. tubulosa gen yon varyete de konpozan aktif, ki gen ladan glikozid phenylethanoid (CPhGs), iridoid, ak polisakarid. Pami anpil konpozan aktif nan C. tubulous, CPhGs yo, ki prezante yon kantite byoaktivite (antioksidan, antifatig, radyo-rezistans, elatriye) se Pie prensipal eleman karakteristik plant sa a. Nan dènye ane yo, yo rapòte ke CPhGis gen twòp efè hepatoprotective Hent, epi yo ka retire radikal pye bwa yo, pwoteje manbràn epatik, epi montre efè imunoregulatwa, anpèchman apoptoz, anpèchman ekspresyon antijèn sifas epatit B (HBs Ag) ak epatit B. e antijèn (HBeAg) ak aktivite replikasyon ADN viris epatit B (HBV), elatriye. Nivo ADN HBV se endèks ki pi serye ki reflete dirèkteman aktivite replikasyon viral, ki se faktè kle nan detèmine istwa natirèl enfeksyon HBV kwonik, kontwole efè terapi antiviral oP, ak evalye pronostik enfeksyon HBV egi ak kwonik. Endis deteksyon serolojik HBV sitou gen ladan HBsAg, HBeAg, elatriye [8-11]. Sepandan, gen kèk rapò literati nan efè fibwoz epatik CPhG yo. Etid anvan yo te endike efè prevantif ak terapetik nan CPhGs sou fibwoz epatik bovine serum albumin (BSA)-induit nan rat, men aktivite a antifibrogenic nan CPhGs ak monomè pi gwo li yo (echinacoside ak acteoside, Figi 1) pa janm te evalye nan vitro.
òganik Cistanche tubulosa
2. Rezilta yo
2.1. Detèminasyon kantite CPhGs
CPhG nanC. tubulosagen ladan de phenylethyl alkòl glikozid: echinacoside ak acteo bò, ak kontni yo nan CPhG yo te detekte pa analiz HPLC (Figi 1) yo dwe 42.71 pousan 土 0.42 pousan ak 14.27 pousan 土 0.18 pousan, respektivman.
2.2. Aktivite inhibition nan CPhGs, Echinacoside ak Acteoside sou HSC-T6
CPhGs, echinacoside ak acteoside (62.5-500 卩g/mL) anpeche viabilite selil HSC nan yon fason ki depann de konsantrasyon. CPhG ak acteoside te montre yon aktivite inhibition remakab sou selil HSC, ak 50 pousan anpèchman nan aktivite kwasans selil (IC50) valè yo te 119.125 昭/mL ak 6.999 昭/mL respektivman. Echinacoside te montre aktivite inhibition modere (IC50,520.345 昭/mL; Tablo 1 ak Figi 2).
2.3. Toksisite selil CPhGs, Echin acoside ak Acteorida sou HSC
Laktat dehydrogenase (LDH), yon anzim cytoplasmic ki estab ki prezan nan tout selil yo, rapidman relwe nan sipènatant kilti selil la sou domaj manbràn plasma. Aktivite anzim nan sipènatant kilti a gen rapò ak pwopòsyon selil lize [12]. Jan yo montre nan Tablo 2, lè yo trete ak diferan: konsantrasyon nan C PhGs, echinacoside ak acteoside, byenke aktivite LDH te montre yon ti ogmantasyon konpare ak gwoup la coirtrol selil, diferans lan pa te estatistik siyifikatif (p> 0.05). ), ki endike ke pi fò nan manbràn selilè yo kenbe entegrite yo, ak anpèchman CPhGs, echinacoside ak acteoside sou HSC se pa akòz toksisite selilè ki pa espesifik.
2.4. Efè CPhGs, Echinacoside ak Acteosde sou pwoliferasyon HSC pwovoke pa TGF-^i
Pwopagasyon, aktivasyon ak diferansyasyon HSC yo reglemante pa yon varyete de faktè. Pami divès faktè ki enplike nan fibwoz fwa, TGF{{0}} konsidere kòm pi enpòtan an, paske li ka aktive HSC, ankouraje diferansyasyon myofibroblast, ogmante sentèz ECM, ak anpeche degradasyon ECM, epi li ka libere chemokines. sitokin ki enplike nan fibwoz fwa [13]. Nan etid sa a, eksepte pou gwoup kontwòl la, HSCs estasyonè yo te ankouraje ak TGF-P1 in vitro pou simulation fòmasyon nan fibwoz fwa bonè, ak mennen ankèt sou efè CPhGs, echinacoside ak acteoside sou TGF-p1- pwovoke pwopagasyon HSC. Jan yo montre Tablo 3 a, konpare ak gwoup kontwòl, gwoup TGF-61 siyifikativman ankouraje pwopagasyon HSC (p <0.01). konpare="" ak="" gwoup="" tgf-p1,="" tgf-p1="" plis="" cphgs="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p=""><0.05), tgf{{18}="" }="" plis="" echinacoside="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05),="" tgf-p1="" plis="" acteoside="" (ta)="" (3.0,="" 6.0="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05)="" tout="" konsiderableman="" anpeche="" pwopagasyon="" nan="" hsc="" pwovoke="" pa="" tgf-|3="" 1="" nan="" diferan="">
2.5. Ekspresyon smad2) smad3 ak smad7 mRNA apre entèvansyon CPhG, ochmacoside ak acteaside sou HSC
Smad3 ak smad2 se efè prensipal en nan chemen siyal TTGF-p [14,15], ak smad7 se yon inibitè nan siyal smad. Teyorikman, ekspresyon an ogmante nan smad7 oswa ekspresyon diminye nan smad2/smad3 ka bloke kondiksyon nan chemen siyal nan TGF-p 1/smad. Jan yo montre nan Figi 3, analiz PCR an tan reyèl te montre ke ekspresyon mRNA nan smad2 ak smad3 te endike yon nivo pi ba, pandan y ap smad7 te endike pi wo nivo nan gwoup kontwòl la, konpare ak gwoup TGF-|31 la. Nan gwoup TC (25, 50, 75,100 |dg/mL), nivo mRNA smad2 (p < 0).{{37="" }}5)="" ak="" smad3="" (p=""><0.01) te="" siyifikativman="" diminye="" konpare="" ak="" gwoup="" tgf-pf="" la,="" e="" li="" te="" menm="" menm="" jan="" ak="" gwoup="" kontwòl="" la;="" mwen="" pandan="" y="" ap,="" nivo="" mrna="" nan="" smad7="" te="" siyifikativman="" ogmante="" nan="" gwoup="" tc="" (50,="" 75,100="" 卩g/ml)="" (p=""><0.05, p=""><0.05, p=""><0.01, respektivman).="" sepandan;="" ekspresyon="" an="" smad7="" endike="" yon="" tandans="" monte="" nan="" gwoup="" thetc="" 25="" 卩g/ml="" konpare="" ak="" gwoup="" la="" tgf-p1="" (figi="">
Antretan, konpare ak gwoup TGF-p1 a, ekspresyon mRNA smad2 ak smad3 te diminye anpil nan TE a (62.5, 125, 250, 500 卩g /mL) gwoup (p <0.01), ak="" ekspresyon="" smad7="" mrna="" yo="" te="" ogmante="" siyifikativman="" nan="" gwoup="" te="" (125,="" 250,500="" 昭/ml)="" (p=""><0.01) (figi="" 4)="" .="" menm="" jan="" an="" tou,="" gwoup="" ta="" (0.75,1.5,="" 3.0,="" 6.0="" ^g/ml)="" te="" montre="" menm="" tandans="" (figi="">
2.6. Enfliyans CPhGs, Echinacoside, ak Ac)eosids sou T GF-^i/smad Siyal Pathway nan HSC
Chemen siyal TGF-p 1/smad depann de smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) ak smad7, kote p-smad2, p-smad3 se fòm aktive smad2 ak smad3. Nan etid sa a, yo te analize nivo pwoteyin omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 ak smad7. Analiz Western blot te detekte ogmantasyon nan nivo smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 pa TGF-p1, ak anpèchman ogmantasyon sa yo pa CPhGs, ec hinacoside ak acteoside; Pandan se tan, analiz wesiern blot te revele nivo smad7 reglemante pa CPhGs, echinacoside ak acteoside. (Figi 6—8).
Jan yo montre nan Figi 6, konpare ak gwoup la c on2rol ( ekspresyon yo pwoteyin nan smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 yo te ogmante siyifikativman, ak ekspresyon pwoteyin smad7 te diminye nan gwoup la TGF-p1. Nan TC a (25) , 50, 75, 100 昭/mL) gwoup dwòg, smad/ (Figi 6A), p-smad2 (Figi 6B), smad 3 (Figi 6C), p -smad3 (Figi 6D) ekspresyon yo te siyifikativman pi ba pase sa yo ki nan gwoup la TGF-p1 (卩 <0.01), ak ekspresyon pwoteyin smad7 (Figi 6E) te pi wo pase sa yo ki nan gwoup la TGF-S1 (p <0.01) (Figi 6).
An menm tan an, ekspresyon ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 ak smad7 pwoteyin yo te mezire apre entèvansyon echinacoside ak acteoside sou HSC. Jan yo montre nan Figi 7 ak 8, nivo ekspresyon pwoteyin smad2, smad3, p-smad2 ak p-smad3 yo te anpeche anpil (p < 0.05="" oswa="" p="">< 0.01="" ),="" nivo="" ekspresyon="" pwoteyin="" smad7="" te="" elve="" (p=""><0.01), konpare="" ak="" gwoup="" tgf-p="" 1="" (figi="" 7="" ak="">
3. Diskisyon
Fibwoz fwa se youn nan kòz prensipal yo nan morbidite ak mòtalite atravè lemond, men opsyon terapetik trè limite yo disponib kounye a pou kondisyon sa a, kidonk, li trè enpòtan pou nou chèche sib potansyèl pou entèvansyon terapetik pou anpeche devlopman fibwoz fwa. 16]. Dènyèman, chèchè yo te jwenn ke divès kalite medikaman èrbal gen epatoprotective nan efè anti-fibrotic. Anpil TCHM tankou Fufang Biejia Ruangan grenn [17] ak Xiao-chai-hu dekoksyon (shosaiko to nan Japon) [18,19] yo te lajman itilize pou trete fibwoz epatik nan Lachin, Kore di, ak Japon pou dè milye ane. C. tubulosa gen yon varyete konpozan aktif ki gen ladan CPhG, iridoid, ak polisakarid. Kòm youn nan baz materyèl efikas nan C. tubulosa, CPhGs posede ekselan aktivite epatoprotective, men gen enfòmasyon limite sou efè anti-fibrotik nan GPhCs ak konpoze ki gen rapò ak li yo. Nan etid sa a, nou te envestige ki jan CPhGs, echinacoside ak acteoside siprime aktivasyon HSC ak bloke siyalizasyon pa thway kondiksyon nan TGF-p1/snaad kòm potansyèl ajan fibwoz anti-epatik nan vitro.
Blesi nan fwa nan nenpòt etyoloji pral finalman mennen nan aktivasyon nan HSCs, ki sibi transdifferentiation nan selil fibrojenik ki tankou myofibroblast [20]. Sa vle di ke myofibroblasts
yo sòti nan aktivasyon ak pwopagasyon HSCss [21], epi li konsidere kòm medyatè fòmasyon fibwoz epatik. Pou rezon sa a, nou te fè etid in vitro pou konpare to viabilite selil HSC yo ekspoze a CPhGs, echinacoside ak acteoside. Rezilta yo te montre ke efè inhibition nan acteoside sou HSC te pi fò a, ak efè a nan CPhGs te pi bon pase sa yo ki nan echinacoside. CPhGs, echinacoside ak acteoside sera medikaman tout inibit pwopagasyon HSC nan yon fason ki depann de dòz la.
LDH se yon anzim sitoplasmik nan selil k ap viv, epi li pa ka antre manbràn selilè a nan sikonstans nòmal. Lè selil yo domaje, pèmeyabilite manbràn ogmante epi LDH lage nan eksteryè selil la. Anjeneral, LDH ka detekte degre selil domaj [{{0}}]. Ankèt la te montre ke aktivite LDH nan CPhGs, echinacoside ak acteoside serom medikaman sèlman te montre yon ti ogmantasyon konpare ak gwoup kontwòl selil la, ak diferans lan pa t 'estatistik enpòtan (p> 0.05), ki endike ke pi fò nan manbràn selilè a kenbe entegrite yo. , ak anpèchman nan HSCs pa CPhGs, echinacoside ak acteoside se pa akòz toksisite selilè nonspecific.
Lè blesi nan fwa rive, epatosit aktive ka lage TGF-pi ki an vire aktive HSC-T6, kidonk, TGF-pi gen yon relasyon sere ak fibwoz [25-27]. Nan etid sa a, CPhGs, echinacoside ak acteoside ta ka konsidere kòm yon estrateji ki ka geri ou atire pou anpèchman pwopagasyon HSC apre HSC yo te ankouraje ak wTGF-pi in vitro. Nou espekile ke CPhGs, echinacoside ak acteoside ka itilize kòm yon kalite tretman ak / oswa prevansyon nan fibwoz fwa, ak anpeche fòmasyon nan fibwoz fwa bonè. Fòmasyon fibwoz epatik la se yon pwosesis konplèks nan patisipasyon miltifaktè ak milti selil. Nan pwosesis patolojik sa a, selil-selil, selil-sitokin ak selil-matris entèraksyon yo konstitye yon rezo ankonbran. Nan rezo sa a, devlopman fibwoz epatik ka kontwole pa diferan chemen siyal ak mwayen. TGF-pi se yon aktivatè klasik nan HSC ak yon medyatè kle nan patojèn fibwoz fwa [28]. CPhGs, echinacoside ak acteoside ka anpeche ekspresyon mRNA ki gen rapò ak chemen TGF-pi/smad ak pwoteyin nan HSC yo.
TGF-pi egzèse efè selilè li yo atravè chemen an siyal smad, epi li te konsidere kòm yon medyatè kle nan devlopman nan fibwoz fwa ak enflamasyon. Lè yo fin mare TGF-pi ak reseptè TGF-p-tip II, reseptè kinaz tip II fosforil domèn GS nan reseptè TGF-p tip I, ki mennen ale nan aktivasyon reseptè tip I [29]. Atravè aksyon p-smad2 ak p-smad3 nan de rezidi serin nan motif SSXS nan tèminal C yo, reyaksyon en nan chemen siyal smad yo aktive pa aktivasyon reseptè tip I [30]. P-smad2 ak p-smad3 fòme konplèks oligomerik ak smad4, Lè sa a, antre nan nwayo a epi fè egzèsis aktivite transkripsyon byolojik yo. Kidonk, pwoteyin smad transmèt siyal dirèkteman nan reseptè kinaz la nan nwayo a [3i]. Nan lòt men an, smad7 byen fèm konbine avèk TGF-pi reseptè, ki mennen nan enkapasite nan smad 2/3 yo dwe aktive kòm byen ke anpèchman nan chemen yo transduction siyal [32]. Smad7 ka aji pou anpeche p-smad2 ak p-smad3, translokasyon nikleyè nan konplèks smad aktive, ak aktivasyon (CAGA) (9)-MLP-Luc, sa ki lakòz diminye ekspresyon kolagen an I ak anpèchman konplè nan transdiksyon siyal TGF-p. [33,34]. Rezilta nou yo te montre ke CPhGs, echinacoside ak acteoside ka diminye ekspresyon mRNA smad2 ak smad3, epi ogmante ekspresyon mRNA smad7; anpeche ekspresyon pwoteyin smad2, p-smad2, smad3 ak p-smad3, epi kontwole ekspresyon pwoteyin smad7, ki sijere ke CPhGs, echinacoside ak acteoside jwe tou yon wòl nan anpeche aktivasyon HSC e konsa anpeche fibwoz epatik, mete aksan sou yon potansyèl anti-fibroz. mekanis.
Sekans efè hepatoprotective twa ajan tès yo te montre actoside > CPhGs > echinacoside. Yo nan lòd yo plis elicide rezon ki fè yo pou diferans ki genyen nan mekanis nan ki CPhGs, echinacoside ak acteoside pwoteje kont fibwoz fwa, yo te analize estrikti chimik yo. Moyete glikozid alkòl phenethyl la sanble yon estrikti esansyèl pou efè epatoprotective [35]. Acteoside (C29H36Oi5) se yon glikozid doub, ak echinacoside (C35H46O20) se yon triglikozid, sa vle di, echinacoside gen yon glikozid siplemantè nan estrikti li yo konpare ak acteoside, ki mennen nan yon ogmantasyon nan gwosè espasyal li yo. Hepatoprotective oswa anpèchman nan aktivite HSC nan acteoside se pi bon pase sa yo ki nan echinacoside, ki ka akòz egzistans la nan antrav esterik.
pwoteje fwa: ekstrè cistanche
4. Seksyon eksperimantal
4.1. Pwodwi chimik ak reyaktif
TGF-pi te achte nan men Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA). Liy selilè HSC-T6 la te achte nan men Wuhan Procell Gene Bio-technology Co, Ltd (Wuhan, Lachin). Dimethyl sulfoxide (DMSO) te achte nan men Sigma Inc. (St. Louis, MO, USA). Smad2, smad3 ak smad7 premye te pwodwi pa Shanghai Sangon Byolojik ak teknolojik konpayi (Shanghai, Lachin). Twous sentèz cDNA Revert Aid premye strand la te achte nan men Thermo Scientific (Shanghai, Lachin). Twous Quantifast SYBR vèt PCR la te achte nan men QIAGEN GmbH (Hilden, Almay). P-smad2 (ser465/467) antikò, Smad3 (C67H9) mAb lapen ak p-smad3 (ser423/425) mAb lapen yo te achte nan men Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). Antikò Smad7 te achte nan men Boster (Wuhan, Lachin). Antikò poliklonal Smad2 ak antikò monoklonal p-aktin te achte nan men Proteintech (Wuhan, Lachin). Deteksyon antikò prensipal yo te fè lè l sèvi avèk solisyon Antikò 2 degre (Alk-Phos. Konjige, Anti-lapen) ak solisyon Antikò 2 degre (Alk-Phos. Konjige, Anti-sourit) te achte nan men Invitrogen™ (Carlsbad, CA, USA). Twous tès laktat dehydrogenase te soti nan Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Lachin).
4.2. Materyèl Plant
C. tubulosa te ranmase nan Tulufan, nan rejyon otonòm Xinjiang Uirghur nan peyi Lachin, nan mwa me 2006. Materyèl plant yo te idantifye kòm C. tubulosa pa Jiang He, Institute of Materia Medica nan Xinjiang. Yo te depoze yon echantiyon bon nan Enstiti Materia Medica nan Xinjiang nan peyi Lachin.
4.3. Izolasyon ak pirifikasyon nan CPhGs ak konpoze li yo
Seche ak tranche rizom nan C. tubulosa (6.0 kg) yo te youn apre lòt ekstrè twa fwa anba rflu ak 70 pousan etanòl (4.8 L), epi yo te retire sòlvan an nan ekstrè konbine yo. bay ekstrè etanòl la (1.146 kg). Ekstrè etanòl yo te pirifye pa AB-8 résine pou jwenn ekstrè fenil etanòl glikosid (CPhG s). Apre yo fin rezoud nan dlo, yo te pirifye akt ekstrè a pa AB-8 adsorption rezin macroporous kwomatografi pou jwenn total fenil etanòl gliko kote yo soti nan C. tubulosa (CPhGs, 210 g). CPhG yo te aplike sou yon kolòn ODS OP{{10}} epi yo te elite youn apre lòt ak melanj MeOH-H?.(0:1 -^1:0). Elua tes yo te konbine nan senk sub fraksyon selon konpòtman TLC lè l sèvi avèk sistèm sòlvan CHCh-MeOH-H?. (6:4:0.5). Tach yo te vizyalize apre flite ak 1 pousan FeCih .Divès fraksyon yo te repete pirifye pa Sephadex LH-20 kolòn kwomatografi ak metanol kòm eluyan, ak de glikozid phenyl etanòl yo te izole nan CPhG yo. Estrikti yo te konfime kòm echinacoside (C35H46O20) ak acteoside (C29H36O15) lè l sèvi avèk MS, 1H-, ak MC-NMR [35], ki pite yo te detèmine yo dwe 99.17 pousan ak 98.92 pousan, respektivman, pa UV-HPLC. Estrikti echinacoside ak acteoside yo montre nan Figi 9.
4.5. Detèminasyon Kantitatif nan CPhGs
Kwomatografi likid (HPLC) (LC{{0}}Yon enstriman HPLC, Shimadzu Co., Kyoto, Japon) te anplwaye pou analize sa ki nan echina coside ak yon cteoside nan CPhG yo. Yon kolòn Phenomenex Gemini ODS (250 x 4.6 mm, 5 |^m) te itilize nan 30 degre. Yo te itilize yon faz izokratik mobil ki fòme ak metanol-acetonitrile -1 pousan asid acetic (15:10:75, v/v/v) pou yon kouri 40 minit, nan yon vitès koule 0.6 mL/min, ak UV. deteksyon nan 334 nm.
4.6. Kilti Selil
Selil HSC yo te kiltive nan mwayen Eagle's modifye Dulbecco (Glukoz Segondè) (DMEM, Beijing, Lachin) siplemantè ak 10 pousan serom fetis bovin (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 10 0 IU/mL penisilin ak 100 ^g/mL streptomycin (HyClone, Logan, UT, USA) nan yon enkibatè imidite a 37 degre ak 5 pousan CO2. Selil sa yo te regilyèman subcultured pa trypsin 0.25 pousan (1x) solisyon (HyClone, Logan, UT, USA) epi yo te chanje mwayen an chak 2 jou. Okòmansman, selil yo te kiltive ak DMEM ki gen 10 pousan FBS pou 48 èdtan. Lè sa a, mwayen an te ranplase ak DMEM san FBS pou mouri grangou selil yo pou 12 èdtan. Selil sa yo te pwopaje pou 48 èdtan epi apre 48 èdtan, serom te mouri grangou ak 0.5 pousan FBS pou 12 èdtan anvan yo ajoute 5 ng/mL TGF-&1,
4.7. Detèminasyon valè IC50
Apre yon enkubasyon lannwit lan nan mwayen grangou ki gen {{0}}.5 pousan FBS, selil HSC yo te simen nan yon plak 96-byen nan yon dansite 5 x 104 selil/mL pou 24 èdtan. Selil HSC yo te trete ak CPhGs, echinacoside ak acteoside nan diferan konsantrasyon (0, 3.90625, 7.8125, 15.625,31.25, 62.5, 125, 250, ak 500 ^ g / mL) pou 48h. Chak konsantrasyon te gen kat pwi. Nan fen tretman an, 20 卩L MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromur] (Sigma; 5 mg/mL) te ajoute epi selil yo te enkube pou yon lòt 4 èdtan. DMSO (200 rL) te ajoute nan chak pi apre yo fin retire supernatant la. Apre souke plak la pou 10 min sou yon shaker, yo te jwenn valè IC50 yo lè w mezire absòbe a nan longèdonn 490 nm lè l sèvi avèk yon enstriman ki make anzim (Benchmark PLUS, Hercules, CA, USA), yo te fè tès sa a twa fwa. Valè IC50 CPhGs, echinacoside ak acteoside te 119.125, 520.345 ak 6.999 Rg/mL, respektivman.
4.8. Efè Anpèchman Pwoliferatif Selil ak Viabilite Selil
Selil HSC yo te ekspoze a diferan konsantrasyon nan CPhGs (25,50,100 Rg / mL), echinacoside (125,250,500 Rg / mL) ak acteoside (1.5,3, 6 Rg / mL). Diferan konsantrasyon nan CPhGs, echinacoside ak acteoside yo te aplike sou plak la nan kat pwi youn apre lòt ak enkube pou 48 èdtan. Efè anpèchman pwopagasyon selil yo ak nivo viabilite selil yo (ki baze sou mezi aktivite LDH lage nan selil ki domaje yo nan supernatant [36]) yo te detèmine pa yon tès MTT. Pousantaj anpèchman an te kalkile lè l sèvi avèk fòmil sa a [37]:
Pousantaj anpèchman (pousan) " [1 — (absorbans mwayèn nan gwoup eksperimantal/absorbans mwayèn nan gwoup kontwòl vid)] x 100 pousan
Dapre enstriksyon twous la,
LDH (U/L) {{0}} (Mezire OD — kontwòl OD)/(estanda OD — blankOD) x 0.2 mmol/L x 1000
Etid preliminè nou an te montre ke CPhGs, echinacoside ak acteoside pa te afekte viabilite selil la.
4.9. Aktivite Anti-Proliferative pa TGF-^1
HSC aktive pa TGF-p1 te konsidere depi lontan yo dwe asosye ak fibwoz fwa, ak anpèchman pou kwasans HSC yo te pwopoze kòm yon metòd pou trete fibwoz fwa [36,38]. Efè anti-proliferatif CPhGs, echinacoside ak acteoside sou HSCs aktive pa TGF-p1 yo te detèmine pa yon tès MTT [39]. Sèvi ak pwosedi yo ak konsantrasyon dwòg jan sa dekri, la
gwoup eksperimantal enkli gwoup kontwòl la, gwoup TGF-pi, TGF-pi plis diferan gwoup dwòg konsantrasyon. Tout gwoup selil eksepte gwoup kontwòl la te kiltive ak DMEM ki gen 5.0 ng/mL TGF-p1 (san FBS) pou 24 èdtan. Aktivite inhibitor sou pwopagasyon selil yo te kalkile kòm 100 x (absòbsyon nan konpoze trete - absorpsyon nan limyè background) / (absorbans nan modèl - absorpsyon nan limyè background).
4.10. Ranvèse transcription-polymerase chèn reyaksyon (RT-PCR)
Nivo ekspresyon mRNA smad2, smad3 ak smad7 te detèmine pa PCR an tan reyèl. Pou detèmine ekspresyon mRNA nan selil HSC, selil yo (5 x 104 selil) yo te simen nan plak sis-pou ak 3.0 mL DMEM ak 10 pousan FBS epi yo te enkube lannwit lan nan 37 degre ak 5 pousan CO2. Apre medya kilti yo te chanje nan serom-gratis DMEM, CPhGs (100,50,25 卩g/mL), echinacoside (500,250,125 昭/mL) ak acteoside (6, 3,1.5 ^g / mL) yo te ajoute nan pwi yo. Apre enkubasyon pou 48 èdtan ak CPhGs ak konpozisyon monomè, RNA total yo te ekstrè lè l sèvi avèk TRIzol reyaktif (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ak ajite kouray ak klowofòm pou 15 s. Apre li te kite kanpe nan tanperati chanm pou 3 minit, lisat la te santrifuje a 12,000 xg pou 15 minit nan 4 degre. RNA nan faz akeuz te presipite ak izopropanol, epi faz akeuz anwo a te transfere nan yon nouvo tib mikrosantrifij. RNA te presipite lè w ajoute 0.75 pousan etanòl, apre sa tib mikrosantrifij la ak santrifuje nan 12,000 xg nan 4 degre pou pa plis pase 5 min. Yo te retire supernatant la epi yo te cheche RNA a nan tanperati chanm pou 5-10 min. Jadendanfan yo (Sangon) yo te fèt lè l sèvi avèk Batch Primer 3, epi yo bay lis nan Tablo 4. Rezilta yo te nòmalize nan mRNA nan jèn p-aktin nan kay la kòm yon kontwòl entèn epi yo prezante kòm nivo mRNA relatif. Reyaksyon yo te fèt ak 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 pM premye pè, 8.5 dlo distile, ak 2.5 rL cDNA.
Chak reyaksyon chèn polymerase te fèt nan kondisyon sa yo: 95 degre pou 3 min, Lè sa a, 40 sik nan 10 s nan 95 degre, 30 s nan 55 degre, ak 10 s nan 55 degre -95 degre pou ekstansyon, ki te swiv pa yon sèl mezi fluoresans. Rezilta final yo te dekri ak valè relatif yo (2_AACt). Kalkil la ak analiz yo te fèt pa iQ5 Real Time PCR Detection System.
4.11. Analiz Western Blot
Ekstrè selil antye yo te prepare lè l sèvi avèk tanpon Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ak 1 pousan Halt inhibitor proteaz ak 1 pousan Halt phosphatase inhibitor cocktails (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Pwoteyin total la te itilize pou deteksyon smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 ak smad7. Konsantrasyon pwoteyin lan te mezire ak quantifiée pa metòd Bradford. Pwoteyin (10-30 Rg) te separe sou yon 10 pousan jèl SDS-PAGE epi yo te transfere nan manbràn fliyòd polivinilidèn (PVDF) (Millipore, Boston, MA, USA). Manbràn yo te bloke pou 1 èdtan nan tanperati chanm ak 5 pousan albumin serom bovin, ak antikò prensipal yo (smad2 poliklonal antikò, p-smad2 antikò, smad3 lapen mAb ak p-smad3 lapen mAb, 1:1000 dilution; lapen mAb nan smad7, 1). :200 dilution, p-actin monoclonal antikò, 1:5000 dilution) yo te enkube nan 4 degre lannwit lan. Alk-Phos ki koresponn lan. antikò segondè konjige yo te enkube nan tanperati chanm. Finalman, manbràn yo te lave twa fwa ak 1 x Tris-HCl saline ak 0.1 pousan Tween 20, ak siyal yo te tcheke ak vizyalize pa yon GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Analiz Densitometrik te fèt sou pwoteyin ki enterese yo ak nòmalize nan p-aktin pa lojisyèl GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). p-aktin te itilize kòm kontwòl entèn la.
4.12. Analiz estatistik
Done yo te eksprime kòm vle di 土 devyasyon estanda (SD). Yo te fè analiz estatistik lè l sèvi avèk lojisyèl SPSS 16.0 (Xinjiang Medical University). Yo te itilize analiz probit pou analize valè IC50 yo. Siyifikasyon diferans lan te kalkile pa yon sèl-fason tès ANOVA, ak valè ak p <0.05 yo="" te="" konsidere="" kòm="" estatistik="">
5. Konklizyon
An konklizyon, CPhGs soti nan C. tubulosa ak eleman li yo echinacoside ak acteoside montre siyifikatif efè anti-fibrotic. Pami yo, aktivite acteoside se pi pwisan an, pandan y ap aktivite CPhG yo se ant de konpoze yo. Anpèchman deklanchman TGF-p1/Smad siyal ka se mekanis ki kache kote CPhG yo pwoteje kont maladi fwa kwonik ki asosye ak fibwoz, ak echinacoside ak acteoside se baz materyèl efikas anti-fibrotic C. tubulosa.
Rekonesans:Rechèch sa a te sipòte pa Fondasyon Nasyonal Syans Natirèl Lachin nan (81260624). Otè yo ta renmen eksprime remèsiman sensè yo bay Pwofesè Tao Liu pou amelyorasyon li ekri nan papye sa a.
Kontribisyon otè:TL, JZ, S.-PY, LM ak S.-LZ te vin ansent ak fèt eksperyans yo. S.-PY, TL ak JZ analize done yo. S.-PY ak JZ te ekri maniskri a. TL, LM ak JZ te revize maniskri a. Tout otè li epi apwouve maniskri final la.
Konfli enterè:Otè yo pa deklare okenn konfli enterè.
Referans
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Devlopman fitomedsin pou maladi fwa. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31,166-175.
2. Friedman, SL Mekanis maladi: Mekanis fibwoz epatik ak enplikasyon terapetik. Nat. Clin. Pratike. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Woule, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Liposit epatik: Selil prensipal ki pwodui kolagen nan fwa nòmal rat. Pwosedi. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Ranvèse nan fibwoz epatik一Reyalite oswa fantezi? H叩atoloji 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Konprann mekanis fibwoz epatik ak potansyèl apwòch terapetik. Arabi J. Gastroenterol. 2012,18,155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Pyè, H.; Raven; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. Nan Flora nan Lachin, 23yèm ed.; Komite Editoryal nan Flora nan Lachin: Chinwa Akademi Syans, Beijing, Lachin, 2013; pp 1-16.
7. Chinwa Pharmacopeia Komisyon Ministè Sanitè Repiblik Pèp la Lachin. Farmakope Chinwa; Pati 1; Endistri Chimik Publishing House: Beijing, Lachin, 2010; p. 126.
8. Li, J.; Huang, D.; Li, L. Efè roucongrong (Herba Cistanches Deserticolae) sou toksisite repwodiktif nan sourit pwovoke pa glikozid nan Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J. Tradit. Manton. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; Liao, J.; Tang, Y.; Zhang, P.; Tan, C.; Ni, H.; Wu, X.; Li, N.; Jia, X. ACE ak inibitè agrégation plakèt soti nan Tamarix hohenackeri Bunge (plant lame nan Herba Cistanches) ap grandi nan Xinjiang. Pharmacogn. Mag. 2014,10,111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salh, B.; Guo, Y.; Ou, P.; Du, C. Amelyorasyon dextran sulfat sodyòm-induit kolit nan sourit pa ekstrè echinacoside-anrichi nan Cistanche tubulosa. Phytother. Res. 28, 2014 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches stimul sikilasyon redox glutatyon selilè pa espès oksijèn reyaktif ki pwodui nan respirasyon mitokondriyo nan kardyomiosit H9c2. Pharm. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A.; Clynes, M. Fosfataz asid: Endpoint pou tès toksisite vitro. Vitro Cell. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF-01 modile ekspresyon matris metaloproteinaz-13 nan selil stellate epatik pa mekanis konplèks ki enplike p38MAPK, PI3-kinase, AKT, ak p70S6k. Am. J. Physiol. Gastrointest fwa fizyol. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; Tang, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. Load kontwole fòmasyon zo ak ekspresyon Sclerostin atravè yon mekanis ki depann de TGFp. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J.; Prunier, C.; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A.; Atfi, A. C-Jun asosye ak oncoprotein Ski a ak siprime aktivite transcription Smad2. J. Biol. Chem. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; Li, M.; Scott, C.; et al. Yon reseptè Vitamin D/SMAD jenomik sikwi pòtay repons fibrotik epatik. Selil 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Efè Fufang Biejia Ruangan Grenn sou fibwoz epatik nan vivo ak nan vitro. Mondyal J. Gastroenterol. 2013,19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I.; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Medikaman èrbal Sho-saiko-to (TJ-9) ogmante ekspresyon matris metalloproteinases (MMPs) ak ekspresyon redwi nan inibitè tisi nan metalloproteinases (TIMPs) nan selil stellate rat. Lavi Sci. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J.; Tsai, C.; Wang, W.; Chang, D.; Ou, DG; Hsieh, HY Wòl TGF-01 ak cytokines nan modulation nan fibwoz fwa pa Sho-saiko-to nan modèl rat/s bile duct ligated. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, EC makè byochimik, eleman ekstraselilè nan fibwoz fwa ak siwoz. Nig. QJ Hosp. Med. 2007,17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Sous ak wòl myofibroblasts nan fibwoz fwa. Manton. Pharmacol. Toro. 27, 2011 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukushima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et al. Modèl ischemi-reperfusion nan kòd epinyè rat: Viabilite selil ak etid siyal apoptoz. Ent. J. Clin. Eksp. Patòl. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Maqbool, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Toksisite nan nanopartikul ak yon BECA de aktyèl modèl eksperimantal. Iran Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]