Amelyorasyon efè anti-anjyojenik Delphinidin lè yo ankapsule nan ti vesik ekstraselilè Pati 1

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Résumé:(1) Background: Anthocyanin delphinidin montre pwopriyete anti-anjyojenik tou de nan modèl anjyojenèz in vitro ak in vivo. Sepandan, nan vivo delphinidin mal absòbe, kidonk modès byodisponibilite li yo ak estabilite diminye efè anti-angiogenic li yo. Travay prezan an pran avantaj de ti pwopriyete vesikil ekstraselilè (EV) pou amelyore tou de estabilite ak efikasite nan delphinidin. Lè encapsulé nan sEVs, delphinidin inibit diferan etap anjyogenesis sou moun aortic endothelial cellules(HAoECs).(2) Metòd: sEVs de cellules dendritic frelikè te pwodwi ak chaje ak delphinidin. Yo te aplike yon metòd ki baze sou UHPLC-HRMS pou evalye metabolit delphinidin nan sEVs. Yo te evalye tès pwoliferasyon, pwodiksyon oksid nitrique (NO), ak tès Matrigel nan HAoEC. delphinidin ak delphinidin-loaded sEVs.sEV-loaded delphinidin te ogmante puisans delphinidin gratis 2-pliye pou pwopagasyon endothelial,10-pli pou pwodiksyon NO endothelial, ak 100-pli pou fòmasyon kapilè. . Se konsa, sEV-chaje delphinidin egzèse efè sou etap sa yo diferan nan anjyogenesis. (4) Konklizyon: sEV yo ka konsidere kòm yon apwòch pwomèt pou delivre delphinidin pou vize maladi ki gen rapò ak anjyogenesis, ki gen ladan kansè ak patoloji ki asosye ak vaskularizasyon depase.

Tanpri klike la a pou w konnen plis

Mo kle: delphinidin; selil andotelyo; anjojenèz; ti vesik ekstraselilè; kansè; maladi kadyovaskilè

1. Entwodiksyon

Yo jwenn polifenol sitou nan manje ak bwason ki sòti nan plant epi yo bay gou ak koulè manje plant yo. Anplis, etid epidemyolojik yo rapòte yon pi gwo rediksyon nan risk kadyovaskilè ak kansè ki asosye ak rejim ki rich nan polifenol [1-3.

Delphinidin (2-(3,4,5-tri-hydroxyphenyl)chromenylium-3,5,7-triol) se yon antosyanin ki idantifye anpil nan legim ak fwi pigman, patikilyèman bè. ak rezen wouj. Nou te deja rapòte ke delphinidin posede menm pwofil famasi a kòm yon ekstrè total de konpoze polifenolik diven wouj pou ankouraje ogmantasyon konsantrasyon kalsyòm intraselilè ak aktivasyon tirozin kinaz [3], ki mennen nan pwodiksyon endothelial nitrique (NO) apre reseptè estwojèn alfa. (ERo)stimulasyon [4]. Anplis de sa, nou rapòte ke delphinidin atravè ERo aji kòm yon molekil imunomodulateur ak anti-enflamatwa ki ka chanje pwopagasyon lenfosit T ak diferansyasyon nan pasyan ki gen faktè risk kadyovaskilè [5].

Finalman, nou te demontre ke delphinidin montre pwopriyete anti-angiogenic, tou de nan modèl anjyogenesis in vitro ak in vivo, epi redwi kwasans timè melanom nan vivo [6-10]. Vreman vre, delphinidin inibit pwopagasyon selil andothelial atravè patisipasyon siklin D 1- ak chemen ki depann de A [6,7]. Nou menm tou nou te rapòte yon asosyasyon posib ant anpèchman byogenesis mitokondriyo VEGF-induit atravè chemen Akt pa delphinidin ak efè anti-anjyojenik li yo [8]. Anplis, delphinidin diminye kwasans timè nan selil timè melanom nan vivo pa aji espesyalman sou pwopagasyon selil andotelyal. Mekanis la implique yon asosyasyon ant anpèchman pwopagasyon VEGF-induit atravè siyal VEGFR2, MAPK, PI3K, ak nan nivo transkripsyon sou faktè CREB / ATF1, ak anpèchman nan phopsphodiesterase2 [9]. Sa ki pi enteresan, dòz segondè nan delphinidin diminye neovaskularizasyon nan yon modèl anjyogenesis in vivo deklanche pa ischemi lè l sèvi avèk yon modèl rat nan ligature atè femoral [10]. Ansanm, done sa yo montre ke delphinidin se yon konpoze pwomèt pou anpeche patoloji ki asosye ak maladi kadyovaskilè ak tumorigenesis.

Sepandan, delphinidin gen mwens pisan pou pwovoke efè benefik sa yo konpare ak ekstrè total polifenol diven wouj, espesyalman nan pwovoke vazodilatasyon NO-medyatè depandan andotelyo [11]. Vreman vre, delphinidin se limyè-sansib ak ki estab sèlman nan pH<3; therefore,="" it="" degrades="" rapidly="" under="" physiological="" conditions.="" moreover,="" delphinidin="" is="" poorly="" absorbed,="" and="" thus="" its="" modest="" bioavailability="" and="" stability="" reduce="" its="" effects="" both="" in="" vitro="" and="" in="" vivo.="" the="" measurement="" of="" delphinidin="" and="" its="" conjugated="" metabolites="" in="" plasma="" indicates="" its="" low="" bioavailability="" [12].="" hence,="" it="" is="" important="" to="" find="" new="" strategies="" to="" enhance="" delphinidin="" bioavailability="" and="">

Yon estrateji pou simonte pwoblèm sa yo se itilizasyon vesik ekstraselilè (EVs) kòm yon sistèm livrezon dwòg. Nou dènyèman te jwenn ke EVs, ki gen ladan gwo ak ti EVs (sEVs), se nanoestrikti ki soti nan diferan pwopriyete lòj subselilè, simonte limit yo nan nano-formulasyon klasik. sEVs diminye enstabilite ak iminojenisite, amelyore byodisponibilite ak selektivite sib [13]. Gen kèk rapò ki anba nòt efè pwoteksyon EV yo pibliye pa selil trete ak polifenol. Vreman vre, sEVs anrichi ak miR-21 ki soti nan selil trete ak kurkumin diminye kwasans selil timè ak anjyogenesis, korije pèmeyabilite andotelyal, ak diminye viabilite selil diferan liy selil kansè yo [14]. Anplis de sa, miR-16-sEVs anrichi soti nan selil trete ak epigallocatechin galat siprime kwasans timè [15].

Cistanche ka amelyore iminite

Nan etid la prezan, nou te pran avantaj de pwopriyete sEV pou amelyore tou de estabilite ak efikasite nan delphinidin.sEV-chaje delphinidin pwovoke anjyogenesis anpèchman lè l sèvi avèk selil endothelial aortik imen (HAoECs). Kontni Delphinidin an tèm de metabolit nan EVs sa yo te detèmine tou.

2. Materyèl ak Metòd

2.1.Kilti Selil

HAoECs (Promocell, Heidelberg, Almay) yo te kiltive nan 37 degre ak 5 pousan CO2 nan mwayen kwasans selil andothelial MV2 (Promocell) konplete ak 1 pousan penisilin/streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Frans). Selil yo te trypsinize nan 70/80 pousan konfluans epi yo te itilize ant pasaj 3 ak 6 pou tout eksperyans.

Liy selil dendritik JAWS II a te achte nan men American Type Culture Collection (CRL-1194; ATCC; Manassas, VA, USA). Selil JAWS II yo te grandi nan 37 degre ak 5 pousan CO, nan yon mwayen kilti konplè ki konpoze de mwayen esansyèl alfa minimòm (Lonza; Basel, Swis) ki gen ribonukleozid ak dezoksiribonukleozid epi yo te konplete ak 20 pousan serom fetal bovine (FBS) (Gibco, Life). Teknoloji; Grand Island, NY, USA), 4 mM L-glutamin (Lonza), 1 mM piruvat sodyòm (Lonza), 1 pousan penisilin/streptomycin (penisilin/-streptomycin, Sigma-Aldrich) ak 5ng/mL murin GM-CSF (Miltenyi Biotec; San Diego, CA, USA). Selil yo te trypsinize nan 70/80 pousan konfluans epi yo te itilize ant pasaj 8 ak 16 pou tout eksperyans.

2.2.sEVIzolasyon

Selil JAWS II yo te simen nan yon dansite selil 5 × 10 degre nan yon flacon kilti selil T175 nan yon mwayen kwasans konplè, epi yo te mouri grangou nan FBS anvan nenpòt izolasyon. Mwayen selil yo te santrifuje nan 300 × g ak 2 000 × g pou 10 min pou retire selil yo ak debri selil yo, respektivman. Sipènatant ki te lakòz yo te santrifuje nan 20, 000 × g pou 30 minit pou eskli gwo EV yo. Sipènatant la te santrifuje nan 200,000×g (Optima MAX-XP ultracentrifuge ak MLA-50 rotor, Beckman Coulter, Villepinte, Frans) pou 2h pou pelletize sEVs. Lè sa a, sEV yo te lave nan saline tampon fosfat (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO410 mM, KH2PO41.8 mM, pH =7.4) ak recentrifuge nan 200,000 × g pou 2 h. Finalman, sEVpellets yo te resuspend nan 1 mL PBS epi estoke nan 4 degre jiskaske yo itilize ki vin apre. Kantite sEV yo te detèmine lè l sèvi avèk metòd Lowry, ak albumin sewòm bovine (Sigma-Aldrich) kòm estanda.sEV yo te itilize nan 10 ug/mL.

2.3. Delphinidin Loading

Delphinidin te prepare nan dlo nan pH{{0}} ak {{10}}.1 pousan DMSO pou yo rive nan konsantrasyon 1{0 ug/mL. Yo te ajoute sEV yo (2 mg), epi yo te brase solisyon an epi li te toubize pou 10 min. Apre 2 èdtan ultracentrifugasyon nan 200, 000 × g, yo te rekonstitye granules yo jwenn nan 1 mL nan 0.1 pousan DMSO oswa PBS. Absorbans Delphinidin te mezire nan 530 nm, epi yo te fè yon koub estanda ak konsantrasyon diferan (0.1 a 10 ug/mL) delphinidin gratis. Pousantaj efikasite chajman sEV yo te 9 pousan, poukont konsantrasyon delphinidin yo te itilize (done yo pa montre). Kidonk, yo te ajiste kantite delphinidin pou jwenn konsantrasyon vle a (0.1 a 5 ug/mL) nan 10 ug/mL sEVs. Pou retire delphinidin gratis, vesik sa yo te lave de fwa.

2.4. Analiz Suivi nanopartikil (NTA)

Echantiyon sEV yo te dilye nan esteril NaCl0.9 pousan, epi yo te analize distribisyon gwosè lè l sèvi avèk NanoSight NS300 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK). Videyo yo te anrejistre. Lojisyèl NTA te detèmine distribisyon gwosè a lè l sèvi avèk ekwasyon Stokes-Enstein.

2.5. Transmisyon Mikwoskopi Elektwonik

sEV yo te premye fiks lannwit lan nan 4 degre ak 2.5 pousan glutaraldehyde (LFG Distribution, Lyon, Frans) nan 0.1 M PBS. Lè sa a, sEVs yo te lave de fwa nan PBS pa 100,000×g santrifujasyon pou 70 min.sEV yo te depoze sou griy kwiv pou 2 min ak negatif tache ak 20 μL nan acetate uranyl 5 pousan (dilye nan etanòl 50 pousan). ）pou 30 s. Lè sa a, kadriyaj yo te obsève ak yon mikwoskòp Jeol JEM 1400 (Jeol, Croissy sur Seine, Frans) ki te opere nan 120 keV.

2.6. Detèminasyon metabolit Delphinidin nan sEVs

Preparasyon echantiyon yo te jan sa a: 250 μL methanol (MeOH) te ajoute nan 10ug sEVs rekonstitye nan PBS, ak echantiyon yo te sibi yon ultrasonication 20 min. De san uL MeOH te ajoute plis, epi echantiyon yo te santrifuje (10, 000 × g, 10 min,4 degre) ak evapore nan yon konsantratè duo miVac (Genevac Ltd., Ipswich, UK). Ekstrè sèk la te rekonstitye ak 200 μL dlo klas LC-MS ki gen 1 pousan asid fòmik. Melanj lan te sibi dezyèm santrifijasyon (10, 000 × g, 5 min, 4 degre) anvan ultra-wo pèfòmans likid chromatografi makonnen ak gwo rezolisyon espektrometri mas (UHPLC-HRMS) analiz yo nan lòd yo analize. metabolit delphinidin ak mezi mas egzat.

Separasyon kwomatografik la te reyalize ak yon kolòn Kinetex@ 1.7 μm XB C18,150×2.1 mm ansanm ak kolòn korespondan SecurityGard C18 (Phenomenex). Faz mobil yo te konpoze de HO nan kanal A ak acetonitrile nan kanal B, tou de ki gen 0.1 pousan asid fòmik. Gradyan elisyon an (A∶B, o/ø) te jan sa a∶ kenbe kondisyon inisyal 95:5 pou 2 minit, ki te swiv pa yon gradyan lineyè soti nan 95:5 rive 0:1{00 sou yon peryòd 6 min, kenbe nan 0:100 pou 3 min, retounen nan kondisyon inisyal 95:5 epi kenbe kondisyon sa yo pou 3.5 min. Yo te itilize yon pousantaj koule konstan nan 0.300 mL / min; volim piki a te 10 μL.

Tout eskanè ak sib mas spectre SIM yo te akeri nan mòd ionizasyon pozitif, lè l sèvi avèk rezolisyon 70, 000 Full Width at Half Maximum (FWHM) ak sib otomatik kontwòl (AGC) nan 3 × 10 degre iyon ak yon piki iyon maksimòm. tan (IT) nan 200 ms. Done-depandan MS/MS eksperyans yo te akeri nan mòd done-depandan Top5 la.

Yo te kontwole metabolit yo rapòte nan literati [16-18]: Delphinidin, alde-id, phloroglucinol aldehyde, asid galik, chalcone, petunidin-3-galactoside, petunidin-3-arabinoside,petunidin {{4} }O-rutinoside, delphinidin-3-arabinoside, delphinidin-3-galactoside, delphinidin 3-O-({6-koumaroylglucoside),delphinidin 3-O- - rutinoside, Cyanidin-3-galaktozid, Cyanidin 3-O- -rutinoside, Peonidin{-3-galaktozid ak malvidin-3-galactoside.

Yo te fè kalibrasyon enstriman chak jou pa perfusion nan twous kalibrasyon Pierce LTO Velos ESI pozitif / negatif jan manifakti a rekòmande. Yo te itilize Xcalibur 2.2 soft-ware (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) pou akizisyon done, epi lojisyèl TraceFinder 3.0 (Thermo Fisher Scientific) te anplwaye pou tretman done.

2.7. Selil Viabilite Essay

1 × 104 HAoEC yo te simen sou yon plak 96-byen epi yo te kiltive pou 24 èdtan epi yo te trete ak delphinidin （1 a 10 ug/mL）. Lè sa a, 5 ug/mL 3-（4,5-dim-thylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl)-2-({ {15}}sulfofenil)-2H-tetrazolyòm (reyaktif MTS, Promega, WI, USA) te ajoute nan chak pi epi enkube a 37 degre pou 120 min. Yo te mezire absorpsyon an sou yon espektrofotomèt CLARIOstar (BMG LABTECH, Ortenberg, Almay) nan 490 nm.

2.8. Esè pwoliferasyon

Yo te fè tès pwoliferasyon lè l sèvi avèk CyQUANT Cell proliferation Assay kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) dapre rekòmandasyon manifakti a. Yon ti tan, 1.5 × 10* selil yo te simen nan yon plak 96-byen. Selil yo te mouri grangou pou 2 èdtan epi yo te trete ak delphinidin, sEV natif natal oswa sEV ki chaje ak delphinidin nan diferan konsantrasyon. Apre 24 èdtan nan enkubasyon, selil yo te lave ak PBS, epi yo te ajoute yon solisyon koloran-obligatwa. Selil yo te enkube a 37 degre pou 30 min. Yo te itilize yon lektè microplate fliyoresan (CLARIOstar9, BMG LABTECH, Ortenberg, Almay) ak filtè pou eksitasyon 485 nm ak emisyon 530 nm pou mezi fluoresans.

2.9.NO Pwodiksyon Assaty

Yo te simen HAoECs sou yon glise 8-byen （Ibidi, Gräfelfing, Almay） nan yon pousantaj de 3×104 selil pou chak pi (sètadi, 3×104 selil/cm²) nan 300 μL nan mwayen an. Nan 70-80 pousan konfluans, selil yo te ankouraje pou 24 èdtan ak delphinidin, sEVs natif natal oswa sEV-chaje delphinidin. Adenosine trifosfat (ATP) te itilize kòm yon kontwòl pozitif (10 μM, Sigma-Aldrich) pou ankouraje pwodiksyon NO. Apre 24 èdtan, yo te retire mwayen chak pi, epi yo te ajoute sond diaminofluorescein dyacetate （DAF-2 DA）(5 μM pou 30 min, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Lè sa a, pwi yo te lave ak PBS. Selil yo te fikse ak paraformaldehyde (4 pousan, 20 min). Fluoresans te li pa mikwoskopi konfokal (Zeiss, Jena, Almay, LSM700). Kat foto yo te akeri, epi yo te itilize lojisyèl ImageJ pou quantification.

2.10.Tès Matrigel

Yo te simen HAoECs nan pwi ki kouvri ak Matrigel (jèl matris ekstraselilè nan sarkòm murin Engelbreth-Holm-Swarm, Sigma-Aldrich). Yon ti tan, yo te mete 10 μL likid Matrigel nan chak pi nan yon 15-pi Ibidi μ- glise plak anjojenèz （lbidi） epi apre enkubasyon pou 45 minit nan 37 degre pou fòme yon jèl.Apre sa, HAoEC yo te simen ak enkubasyon nan 37 degre ak 5 pousan CO, pou 45 minit anvan tretman ak swa delphinidin, sEV natif natal oswa sEV-chaje delphinidin. , ki te swiv pa yon enkubasyon nan 12 a 14h nan 37 degre ak 5 pousan CO. Yo te obsève fòmasyon "kapilè-tankou estrikti" ak yon mikwoskòp optik (Olympus CK40). Quantification te fèt pa mezire kantite estrikti kapilè-tankou lè l sèvi avèk Lojisyèl Imaj.

2.11.Estatistik analiz

Rezilta yo eksprime kòm mwayen ± SEM. Siyifikasyon diferans ki genyen ant gwoup yo te detèmine pa analiz divèjans (ANOVA), ki te swiv pa tès konparezon miltip Tukey a. p-valè nan<0.05 were="" considered="">

3. Rezilta yo

3.1.sEV Karakterizasyon ak chaj Delphinidin

Nan akò ak literati a, delphinidin chaje nan sEVs pa t 'pwovoke chanjman nan gwosè a nan vesik yo, yo te 118.7± 2.9 ak 111.7± 1.8nm pou sEVs vid ak sEVs delphinidin-chaje, respektivman, jan yo detèmine pa analiz Tracking nanopartikil (Figi). 1A) ak konfime pa analiz mikwoskòp elèktron (Figi 1B). Anplis de sa, tou de kalite sEV, natif natal ak sa ki chaje ak delphinidin, eksprime makè eksosomal tankou ALIX, CD63, ak TSG101 nan nivo menm jan an (Figi 1C), tandiske yo pa t 'eksprime ß-aktin, yon makè nan gwo EVs.

Figi 1. Karakterizasyon sEVs.(A) Distribisyon gwosè sEV natif natal ak sEV ki chaje ak delphinidin ki baze sou mezi NTA. (B) Imaj mikwoskopi elektwonik transmisyon reprezantatif sEV natif natal ak sEV ki chaje ak delphinidin. Ba echèl=100 nm.(C) Analiz Western Blot ki montre ekspresyon Alix, CD63, TSG101, ak ß-Actin nan sEVs ak sEVs ki chaje ak delphinidin.

Atik sa a soti nan eleman nitritif 2021, 13, 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378