Herba Cistanche ekstrè amelyore estati mitokondriyo glutatyon ak respirasyon nan kè rat, ak endiksyon posib nan pwoteyin dekouplage.

Entwodiksyon

Repèfizyon nan yon myokad deja ischemic lakòz yon seri de chanjman mitokondriyo, ki gen ladan ogmante pwodiksyon espès oksijèn reyaktif (ROS), Ca2+Surcharge, ak yon bès nan pwodiksyon adenosine trifosfat (ATP), tout sa ki ka mennen nan nekwoz ak / oswa apoptoz-medyatè lanmò selil (Redegeld et al., 1992; Lemasters et al., 1998). Kòm mitokondri jwe yon wòl enpòtan nan determIning sò a nan kardyomyosit apre yon defi ischemi/reperfusion (I/R), pwoteksyon kont blesi myokad I/R ta dwe se poutèt sa dwe vize nan direksyon prezèvasyon nan mitokondriyo estriktirèl ak fonksyonèl entegrite. Antretyen nan metabolis enèji mitokondriyo apre defi a I / R se patikilyèman enpòtan paske fonksyon kè kontraksyon se prèske antyèman depann sou mitokondriya-pwodwi ATP. Cardiomyosit ki vivan men ki pa kontra yo pa itil anpil.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU ORGANISE IMINITE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, plant la antye sèk nanCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae), se yon plant parazit k ap grandi sitou nan zòn dezè nan nò ak nòdès Lachin. Herba Cistanche, ki klase kòm yon zèb "Yang-dinamize" nan medikaman Chinwa, yo preskri pou deficiency nan ren, esterilite fi, ak konstipasyon ki rive nan sechrès entesten nan pasyan senil (Chen, 1998). Syans anvan yo nan laboratwa nou an te montre ke yon metanolekstrè Herba Cistancheogmante kapasite jenerasyon ATP myokad (Leung & Ko, 2008) ak pwoteje kont blesi myokad I/R nan rat (Leung, 2006). Lè nou konsidere ke eksitasyon nan kapasite jenerasyon ATP te paralèl ak amelyorasyon nan transpò elektwon mitokondriyo (Leung & Ko, 2008), kadyopwoteksyon kont blesi I / R bay pa tretman Herba Cistanche te asosye ak yon diminisyon nan rediksyon ATP myokad (Leung, 2006). Nan etid prezan an, pou defini wòl mitokondri nan aksyon kardyopwotektif Herba Cistanche, nou te envestige efè tretman Herba Cistanche sou estati glutatyon mitokondriyo, kontni Ca2+, potansyèl manbràn, ak to respirasyon, nan kè rat. .

Materyèl ak metòd

Materyèl èrbal

Herba Cistanche te achte nan men yon konsesyonè èrbal lokal (ki baze nan Hong Kong) (Lee Hoong Kee). Zèb la te otantifye pa founisè a epi yo te depoze yon echantiyon bon (HKUST00301) nan Depatman byochimik, Hong Kong University of Science & Technology (HKUST). Methanol fè ekstraksyon nan zèb la te fèt, ki baze sou etid anvan ki endike ke tankou yon ekstrè amelyore jenerasyon ATP mitokondriyo ak pwoteje kont blesi I / R nan kè rat (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). An brèf, Herba Cistanche (400 g) te koupe an ti moso ak extrait pa chofaj anba rflu nan 300mL metanol nan 60 degre pou 2h, jan sa te dekri deja (Leung & Ko, 2008). Pwosedi a te repete de fwa. Te ekstrè nan pisin cheche pa evapore sòlvan an anba presyon redwi; sede a te 42% (w/w) konsènan kantite zèb brut. Ekstrè a te estoke nan 4 degre jiskaske yo itilize. Malgre ke remèd fèy Chinwa yo tradisyonèlman ekstrè dlo pou konsomasyon oral, methanol te itilize nan etid pi bonè nou an pou konvenyans nan pwosesis ak depo echantiyon yo (Yim & Ko, 2002), epi nou te jwenn ekstraksyon metanol yo dwe satisfezan nan tout respè.

Swen bèt ak tretman dwòg

Rat Sprague-Dawley granmoun fi (8-10 semèn; 200-230 g) te loje nan yon chanm imidite kontwole, ak yon sik fènwa/limyè 12h, nan apeprè 22 degre, epi yo te pèmèt manje ak dlo ad libitum. Bèt yo te plase owaza nan diferan gwoup, ak senk bèt nan chak gwoup. Rat te resevwa aHerba Cistanche ekstrèintragastrik ({{0}}.2 g/mL nan dlo) nan 0.5g/kg oswa 1.0 g/kg pou 3 jou youn apre lòt. Kontwole (ki pa trete) bèt yo te resevwa dlo sèlman. Vennkat èdtan apre dènye dòz la, yo te jwenn tisi ventrikulè kè nan bèt anestezi pou analiz byochimik. Tout pwotokòl eksperimantal yo te apwouve pa Komite Pratik rechèch la, HKUST.

Preparasyon nan fraksyon mitokondriyo

Tisi vantrikulè kè mens (~{{0}}.6g) yo te omojènize nan yon 10-pliye (w/v) depase tanpon sikwoz frèt [0.32M sikwoz, 1mM etilèn dyamin tetraacetic asid. (EDTA), 50mM Tris/HCl; pH 7.4] lè l sèvi avèk yon omojèn Teflon-vè, nan 4000 rpm, ak 25-30 kou. Granules mitokondriyo yo te prepare soti nan omojene tisi pa santrifijasyon nan 800 × g nan 4 degre pou 30min, epi yo te detèmine pite pa mezi aktivite espesifik relatif succinate dehydrogenase ak lactate dehydrogenase nan supernatant la ak granules, respektivman, jan sa deja dekri (Evans, 1992). Granules mitokondriyo yo te sispann nan 1mL tanpon omojèn.

Mezi mitokondriyo redwi glutatyon ak nivo glutatyon oksidize

Nivo mitokondriyo redwi glutatyon (GSH) yo te detèmine anzimatikman lè l sèvi avèk 5,59-dithiobis (2- asid nitrobenzoik) (DTNB) ak glutatyon reduktaz (GR), nan yon pwotokòl modifye nan Griffith (198{{17} }). Yo te melanje yon alikòt (210 µL) nan fraksyon mitokondriyo a ak 90 µL nan 10% (v/v) 5-asid sulfosalisilik (SSA) ak melanj te santrifuje nan 600 × g pou 10min. Pou mezire nivo glutatyon oksidize (GSSG), yo te melanje 100µL kantite supernatant SSA ak 10 µL 20% (w/v) 2-vinylpyridine ak 10 µL 60% (v/v) trietanolamin nan tib mikrofuge. Yo te pèmèt chak tib kanpe nan tanperati chanm pou omwen 1 èdtan. Yon melanj reyaksyon ki gen 0.63mM DTNB ak 0.053mM NADPH (redwi nikotinamid adenine dinukleotid fosfat) nan tanpon fosfat (0.1M, ak 5mM Na2 EDTA; pH7.5) te pre-enkube nan 30 degre pou 2min. Yo te ajoute yon alikòt (30 µL) swa yon echantiyon SSA sipènatant (total glutatyon) oswa yon echantiyon GSSG nan yon pi yon plak mikwotitre 96-byen, ak 180 µL melanj reyaksyon pre-chofe, ki gen 0.525U/ mL GR, te pwochen te ajoute. Chanjman absorpsyon nan 412nm yo te kontwole espektrofotometrik pou 5min. Konsantrasyon GSH ak GSSG yo te estime nan koub kalibrasyon lè l sèvi avèk GSH ak GSSG [fonn nan 3% (w / v) SSA] kòm estanda ak eksprime kòm nmol / mg pwoteyin. Nivo GSH yo te estime pa soustraksyon de fwa kantite GSSG soti nan GSH total.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMELIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mezi kontni mitokondrial Ca2+

Kontni Mitokondriyo Ca{{0}} yo te mezire lè l sèvi avèk yon sond fluoresans Ca{2+-sansib, Fluo-5N AM ester (Molecular Probes, Eugene, OR) ki te anplwaye Victor2 Multi-Label Counter. (Modèl 1420; PerkinElmer, Turku, Fenlann), jan yo dekri nan Menze et al. (2005). Konstan disosyasyon Ca2+ (valè Kd) yo te detèmine lè l sèvi avèk yon twous kalibrasyon Ca{2+ ki valab nan seri konsantrasyon 1–1000 µM; estime valè Kd yo te 90–100 µM, ak gwo fyab, dapre done manifakti twous la. Yon aliquot (25µL) nan fraksyon mitokondriyo (0.5mg pwoteyin/mL konsantrasyon final) te melanje ak 25 µL tanpon enkubasyon {100mM KCl ak 30mM MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic asid]; pH7.2} nan yon 96-plak mikwotiter byen nwa. Te melanj lan enkube nan 25 degre pou 15 min; Lè sa a, yo te ajoute 25 µL digitonin (50 µg/mL) ak 25 µL Fluo-5N AM ester (1 µM nan 0.005% (w/v) Pluronic F-127). Pa fasilite permeation manbràn, digitonin medyatè antre mitokondriyo nan lank fliyoresan. Nou te jwenn ke nivo Fluo-5N nan preparasyon mitokondriyo kè rat yo te ogmante 20-pliye nan prezans digitonin. Melanj reyaksyon yo te enkube nan 25 degre pou 30 minit, ak lekti fluoresans yo te mezire nan yon longèdonn eksitasyon nan 488nm ak yon longèdonn emisyon nan 532nm. Yo te estime kontni Mitokondriyo Ca2+ lè l sèvi avèk yon koub kalibrasyon epi yo te eksprime kòm µmol/mg pwoteyin.

Mezi potansyèl manbràn mitokondriyo

Potansyèl manbràn (ΔΨm) te evalye pa yon metòd modifye soti nan sa yo ki nan Bonavita et al. (2003), lè l sèvi avèk yon lank fliyoresan, lipophilic cationic sond 5,596,69- tetrachloro-1,193,39-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide, souvan rele JC-1. Aliquot (50 µL) nan fraksyon mitokondriyo (ajiste a 1mg pwoteyin/mL) yo te enkube nan 37 degre ak 50 µL nan solisyon substra (ki gen 6mM piruvat ak 6mM malat), 25 µL nan solisyon adenozin difosfat (ADP), 30mM. ak 25 µL 3 µM JC-1, nan fè nwa. Valè ΔΨm yo te jwenn lè yo mezire fliyoresans nan 535nm (FL1) kont 580nm (FL2), lè l sèvi avèk Victor2 MultiLabel Counter. JC -1 fòme total nan mitokondri, sa ki lakòz gwo valè fliyoresan FL2 epi ki endike potansyèl nòmal mitokondriyo. Pèt ΔΨm mennen nan yon rediksyon nan FL2 fliyoresans (JC-1 total nan yon pi piti limit) ak yon ogmantasyon koncomitan nan FL1 fliyoresans (soti nan JC-1 monomè). Done yo te eksprime kòm rapò valè fliyoresan FL1/FL2. Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), yon ajan ΔΨm-effondreman, te itilize pou valide tès la.

Mezi respirasyon mitokondriyo

Yo te mezire to respirasyon mitokondriyo a 37 degre lè l sèvi avèk yon enstriman Hansatech Oxygraph-Plus ekipe ak yon elektwòd oksijèn Clark-type (Sarasota, FL, USA). Fraksyon mitokondriyo (0.6mg pwoteyin/mL) yo te sispann nan tanpon respirasyon ki gen 125mM KCl, 20mM MOPS, 10mM Tris, 0.5mM etilèn glikol tetraacetic asid (EGTA), ak 2mM KH2 PO4; pH 7.2. Apre enkubasyon nan 37 degre pou 2min, chak echantiyon te resevwa 50 µL solisyon substra (5mM piruvat ak 5mM malat). Pousantaj respirasyon yo te mezire nan prezans (Eta 3) nan 1mM ADP ak apre fosforilasyon tout ADP nan ATP (Eta 4). Rapò Eta 3: Eta 4 to respirasyon se endèks kontwòl respiratwa a, ki endike sere nan kouple ant respirasyon ak fosforilasyon (Javadov et al., 2005; Kuwabara et al., 1997). Anvan adisyon nan solisyon substrate, yo te mezire to respirasyon Eta 1 jiska kòmansman respirasyon Eta 2, epi yo te estime to respirasyon Eta 2 anvan adisyon ADP.

Analiz estatistik

Done yo te analize pa yon sèl-fason analiz de divèjans (ANOVA) pou konparezon gwoup miltip. Pi piti diferans enpòtan (LSD) yo te itilize pou idantifye diferans enpòtan ant de gwoup yo lè valè p yo te < 0.05.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMELIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezilta yo

Jan yo montre nan Figi 1 ak 2, tretman ak yon metanolekstrè Herba Cistanche({{0}}.5 oswa 1.0g/kg/jou×3) siyifikativman amelyore estati mitokondriyo glutatyon nan kè rat, jan sa evidans ogmantasyon dòz ki depann de nivo GSH (11-30%) ak diminye nan Nivo GSSG (31%).

Tretman Herba Cistanche depann de dòz la diminye nivo mitokondriyo Ca2+ nan kè rat konpare ak kontwòl; repwesyon te 41% nan yon dòz 1.0 g / kg (Figi 3).

Tretman Herba Cistanche ogmante mitokondriyo ΔΨm, jan sa pwouve pa yon diminisyon (14-16%) nan rapò FL1/FL2. CCCP (100 µM) te lakòz ΔΨm efondreman, jan sa endike nan yon ogmantasyon nan rapò FL1/FL2 (Figi 4).

Tretman Herba Cistancheamelyore respirasyon mitokondriyo, jan sa pwouve pa yon to siyifikativman pi wo nan respirasyon Eta 3 (84%) nan bèt tès yo konpare ak kontwòl (Tablo 1). Nivo respirasyon Eta 2 ak Eta 4 te ogmante pa 47 ak 80%, respektivman, men eksitasyon nan respirasyon Eta 4 te konplètman siprime pa 1mM guanosine-5'-diphosphate, yon inibitè nan dekoupling pwoteyin 2/3. Tretman Herba Cistanche pa t afekte endèks kontwòl respiratwa a, jan rapò pousantaj respirasyon Eta 3/Eta 4 estime.

Diskisyon

Mitokondri izole nan kè rat Herba Cistanche-trete te montre estati glutatyon amelyore, jan sa endike nan ogmante nivo GSH ak diminye nivo GSSG. Antretyen estati mitokondriyo glutatyon redox enpòtan pou kadyopwoteksyon kont blesi I/R (Chiu & Ko, 2003). Kontni Ca2+ sitosolik ogmante pandan iskemi myokad, atravè absòpsyon nan manbràn enteryè Ca2+ uniporter (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990), ki mennen nan mitokondriyo Ca{{6} } akimilasyon. Rezilta nou yo endike ke tretman ak Herba Cistanche ekstrè amelyore estati redox mitokondriyo glutathione ak diminye nivo mitokondriyo Ca 2+, ki ka bay pwoteksyon kont blesi myokad I / R (Leung, 2006). Enkapasite tretman Herba Cistanche, nan yon dòz ki pi wo nan 1.0 g/kg, pou diminye plis nivo GSSG ak Ca2+, ka gen rapò ak egzistans yon mekanis regilasyon oto-limite ki afekte potansyèl redox glutatyon ak estati kalsyòm. nan mitokondri.

Mitokondri yo jenere yon gradyan pwoton elektwochimik atravè manbràn enteryè a, pa transpò elektwon. Sa a gradyan itilize pa ATP sentaz pou fosforil ADP nan ATP. Diminye potansyèl manbràn mitokondriyo, tankou nan ipoksi / reoksijenasyon apre aksidan nan kardyomyosit kiltive (Chiu et al., 2008), rezilta nan yon rediksyon nan jenerasyon ATP. Tretman Herba Cistanche, ki ka ogmante potansyèl manbràn mitokondriyo myokad, petèt amelyore jenerasyon ATP, patikilyèman pandan repèfizyon post-ischemik. Yon fwa ankò, egzistans lan nan yon mekanis pwòp tèt ou-limite regilasyon ka eksplike poukisa efè tretman Herba Cistanche sou potansyèl manbràn mitokondriyo yo pa dòz-depandan.

Tretman Herba Cistanche ogmante anpil pousantaj respirasyon Eta 3 nan mitokondri kè rat, jan yo evalye konsomasyon oksijèn. Konklizyon sa a konsistan avèk rezilta yo jwenn nan mezi vitro ak situ nan kapasite jenerasyon mitokondriyo ATP (Leung & Ko, 2008). Entrigan, byenke tretman Herba Cistanche redwi nivo fiks nan ATP myokad (done yo pa montre), tretman an amelyore jenerasyon ATP mitokondriyo. Patisipasyon nan respirasyon dekonekte ka eksplike obsèvasyon sa yo ki dispozisyon. Fosforilasyon oksidatif dekouplè rive lè pwoton yo deplase atravè manbràn enteryè mitokondriyo a tounen nan matris mitokondriyo a, konsa dissipation potansyèl manbràn ki te fòme pa chèn transpò elèktron. Sa a lakòz yon rediksyon nan fòs la proton-motif ki kondwi fòmasyon ATP (Garvey, 2003). Kòm yon konsekans, konsantrasyon Ca2+ ak pwodiksyon ROS nan mitokondri yo dramatikman diminye (Teshima et al., 2003). Sijesyon sa a konsistan avèk rezilta etid prezan an, ki te montre yon diminisyon nan nivo mitokondriyo Ca2+ nan kè Herba Cistanche trete. Konsènan respirasyon dekonekte, sentèz pwoteyin dekoupling (UCP) ka pwovoke pa tretman Herba Cistanche. Yo konnen UCP yo dekouple fosforilasyon oksidatif, ak ekspresyon UCP1 nan kè sourit transjenik pwoteje kont domaj myokad I/R-induit (Hoerter et al., 2004). Efè dekoupaj UCP yo te anpeche difosfat purin nukleotid ak trifosfat (tankou ADP, ATP, guanosine diphosphate (GDP), ak GTP) (Echtay et al., 2002). Nan etid la prezan, paramèt mitokondriyo tankou potansyèl manbràn ak to respirasyon yo te mezire nan prezans ADP (kòm substra); Se poutèt sa, efè dekoupaj UCP yo te anpeche. Sepandan, lè yo te mezire to respirasyon Mitokondriyo Eta 4 nan absans ADP, to sa a te pi wo nan mitokondri ki te prepare nan kè Herba Cistanche-trete pase nan kè kontwòl ki pa trete. Pousantaj respirasyon Eta 4 la reflete konsomasyon oksijèn pa mitokondri lè pwoton yo koule tounen nan matris mitokondriyo a atravè yon mekanis ki pa enplike F1 F0 -ATPase (Garvey, 2003). Patisipasyon posib nan UCP yo nan ogmantasyon Herba Cistanche-induit nan respirasyon Eta 4 sipòte pa jwenn ke amelyorasyon sa a te siprime pa GDP (Bento et al., 2007).

An konklizyon, tretman ak Herba Cistanche ka amelyore estati glutatyon mitokondriyo, diminye nivo mitokondriyo Ca2+, epi ogmante potansyèl manbràn mitokondriyo ak to respirasyon nan kè rat. Amelyorasyon estati glutatyon mitokondriyo ak kapasite fonksyonèl, ak endiksyon putativ nan UCP yo, ka gen rapò ak kadyopwoteksyon an bay paTretman Herba Cistancheapre blesi I/R.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA PLANT CISTANCHE EXTRACT PHGS75% ECH 30% ACT 12%