LRRK2 kinaz inibitè rajenisman oksidatif estrès-pwovoke senesans selilè nan selil newòn Pati 1

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Background.Leucine ki rich repete kinaz 2 (LRRK2) jwe yon wòl enpòtan nan patojèn nan maladi Parkinson la (PD). Aje se faktè risk ki pi enpòtan pou pwogresyon PD. Te korelasyon ki genyen ant aje ak senesans selilè yo te etabli. Selilè senesans se Koehle ak dysregulation nan chemen an pwoteolitik ak malfonksyònman mitokondriyo, ki fè yo tou ki asosye ak agrégation nan -synuclein (-syn). Selil dopaminèjik ki sanble ak newòn imen (selil SH-SY5Y diferan) yo te trete ak rotenone nan prezans oswa absans inibitè kinaz LRRK2 GSK2578215A (GSK-KI) pou 48 èdtan. Makè yo nan senesans selilè, ki gen ladan p53, p21Wafi/Cip1 (p21), -galactosidase (-gal), fosforilasyon Rb, aktivite ki asosye ak senesans (SA) -gal, aklizozomalaktivite, yo te egzamine. Selil priz yo ak newòn kortik prensipal rat yo te trete ak -syn fibrils 30 minit anvan tretman ak rotenone nan prezans oswa absans GSK-KI pou 48 èdtan. Sourit yo te enjekte intraperitoneally ak rotenone ak MLi -2 (LRRK2 kinase inhibitor) yon fwa chak de jou pou de semèn. Rezilta yo. Rotenone ogmante fosforilasyon LRRK2 ak nivo -gal atravè aktivasyon aks siyal p53-p21 la ak fosforilasyon Rb downregulated. Anplis de sa, rotenone ogmante aktivite SA -gal, nivo espès oksijèn reyaktif, ak LRRK2.fosforilasyonak inibit aktivite lizozom. Rotenone-induit LRRK2 upregulation andikape clearance nan a-syn fibrils. Tretman ak inibitè LRRK2 diminye rotenone-pwovoke senesans selilè ak akimilasyon -syn. Konklizyon. Rotenone-induit upregulation nan aktivite LRRK2 kinaz ankouraje senesans selilè, ki amelyore akimilasyon -syn. Sepandan, administrasyon an nan yon inibitè kinaz LRRK2 rajenisman rotenone-pwovoke senesans selilè.

Tanpri klike la a pou w konnen plis

1. Entwodiksyon

Maladi Parkinson la (PD), ki se maladi neurodegenerative ki pi komen, karakterize pa kontwòl motè ki gen pwoblèm[1]. Plizyè faktè jenetik ak anviwònman kontribye nan patojèn nan PD[2-5].LRRK2, yon gwo faktè risk jenetik pou PD, montre tou de aktivite GTPase ak kinaz [6]. LRRK2 G2019S mutan, ki montre aktivite kinaz amelyore, ankouraje pwogresyon PD [7]. Risk pou devlope PD nan pasyan ki genyen mutan G2019S la ogmante ak laj [8] kòm aje asosye ak pwogresyon maladi neurodegenerative [9]. Précédemment, nou te rapòte ke aktivite kinaz LRRK2 ankouraje senesans selilè ak anpeche degradasyon total alfa-synuclein (-syn) [10]. -Syn se yon eleman enpòtan nan kò Lewy (LB) oswa Lewy neurites, ki se makè postmortem nan PD. Degradasyon pwoblèm -syn rezilta nan agrégation li yo [11].

Senesans selilè afekte machin degradasyon pwoteyin yo[12-14]. Ekspozisyon nan rotenone ki ba-dòz, ki rapòte ke pwovoke PD, ankouraje senesans selilè nan liy selil trabecular imen an [15]. Anplis de sa, rotenone ogmante aktivite kinaz LRRK2 nan newòn yo [16]. Se poutèt sa, nou te sipoze ke rotenone ankouraje senesans selilè atravè aktivasyon nan LRRK2 kinaz ak kidonk amelyore agrégation -syn.

Cistanche ka amelyore iminite

2. Metòd ak Materyèl

2.1. Kilti Selil ak Tretman.

Liy selil neuroblastom imen an (selil SH-SY5Y) yo te kiltive nan yon mwayen kwasans (medyòm Dulbecco a modifye Eagle's (DMEM;10-013-CV; Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)) ki te konplete ak 1{{ 48}} pousan serom fetis bovin (FBS, 35-010-CV, Corning cellgro), 1 pousan penisilin/streptomycin (P/S, 10378-016, Gibco, Thermo Fisher Scientific), ak 1 pousan reyaktif pou retire mikoplasm. (KOMA)) nan 37 degre nan yon 5 pousan CO, enkibatè (Thermo Fisher Scientific). Selil SH-SY5Y différenciés yo (selil dSH) yo te jwenn apre tretman ak 10μM tout-trans retinoic asid （R2625-100MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) prepare nan yon mwayen kwasans yon fwa chak de. jou pou sèt jou. Nan jou 7 apre tretman asid retinoid, selil yo te cotreated ak rotenone (1 uM) ak GSK2572815A（GSK-KI; LRRK2 inibitè kinaz; 1μM) prepare nan yon mwayen kwasans pou 48 èdtan. Dimethyl sulfoxide (DMSO) te itilize kòm yon machin pou rotenone ak GSK-KI. Fibril -syn yo te pirifye jan sa dekri deja [10]. Selil yo trete rotenone ak GSK-KI yo te trete ak a-syn fibrils (70nM). Rat prensipal newòn cortical yo te trete ak rotenone (1μM), GSK-KI (l μM), ak a-syn fibril (70nM) pou 48h. Kondisyon tretman yo pou newòn kortik prensipal rat yo te idantik ak sa yo te anplwaye pou dSH. Selil yo te lave de fwa ak glas-frèt fosfat-tanpon saline (PBS) ak lysed nan 1x echantiyon tanpon (50mM Tris-HCl (pH6.8), 2 pousan sodyòm dodecyl sulfat, 10 pousan gliserin, 1 pousan -mercaptoethanol, ak 0.02 pousan bromofenol ble).

2.2.Izolasyon ak Kilti Newòn Cortical Prensipal ki soti nan anbriyon rat E16.

Rat ansent yo te euthanized ak CO, gaz. Matris la te diseke, epi fetis ki soti nan sak anbriyon yo te mete nan glas HBSS-/-(14175-079, Gibco, Thermo Fisher Scientific). Zo bwa tèt la te kale lè l sèvi avèk forceps, epi kortik yo te diseke nan tout sèvo a. Apre yo te retire menenj yo, yo te enkube kortik yo ak 0.25 pousan Trypsin-EDTA(25200-056, Gibco, Thermo Fisher Scientific) nan 37 degre C pou 20min nan yon ti tan. beny dlo. Apre sa, kortik yo te enkube ak 40ug/mL DNase I (DN25, Sigma-Aldrich), toubiyon dousman, ak enkubasyon pou 5min nan yon beny dlo 37 degre. Pifò nan supernatant la te retire pa aspirasyon, epi echantiyon yo te enkube ak yon serik inhibitor ki gen MEM (11090-08, Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1.5 pousan DMEM, 5 pousan FBS, 2.5 mg/mL albumin serik bovin. (BSA; A7906, Sigma-Aldrich), ak 2.5 mg/mL trypsin inhibitor (T9253, Sigma-Aldrich). Yo te retire inibitè serik la, epi granules selil la te resuspend nan 10 fwa volim li yo ak mwayen kwasans lan. Konpozisyon mwayen kwasans lan te jan sa a: medyòm nerobazal (21103-049, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific), 2 pousan B-27(17504044, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific), ak 1x GlutaMAX{ {34}}(35050-061, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific). Selil newòn kortik prensipal rat izole yo (3 × 10 degre / byen) yo te simen nan yon plak 12-byen (SPL30012, SPL Life Sciences, Pochoen, Kore di Sid) epi yo te kiltive nan mwayen kwasans lan nan 37 degre nan yon 5. pousan CO, enkibatè pou 24h. Mwayen kilti a te ranplase ak mwayen kwasans ki te konplete ak 0.2mg/mL 5-fluoro-2'-deoxyuridine (F0503, Sigma-Aldrich) ak 96ug/mL uridine (U3750, Sigma-Aldrich) pou anpeche mitoz. Nan jou 6, selil yo te trete ak 1uM rotenone, 1uM GSK-KI, ak 70nM -syn fibrils pou 48h ak rekòlte ak tanpon echantiyon lx.

2.3. Western Blot.

Western blotting te fèt jan sa dekri deja [17]. Antikò sa yo yo te itilize pou Western blotting la: lapen anti-LRRK2 fosfo-S935 monoklonal (ab133450, Abcam, Cambridge, UK), lapen ti jan anti-LRRK2 fosfo-S1292 monoklonal (ab203181, Abcam), sourit anti-LRRK2 monoklonal ( N241A/34, Neu-roMab, UC Davis, CA, USA), sourit anti-p53 monoklonal (pou moun p53:sc-126; pou sourit p53:sc-393031; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), sourit anti-p21wafi/-Ccip1 (p21) monoklonal (CM5131, ECM Biosciences, Ver-sailles, KY, USA), sourit anti-Rb monoklonal (#9309S, Cell Signaling Technology (CST), Danvers, MA). , USA), anti-phosphoRb (Ser807/811) (#9308S, CST), sourit anti- -galactosidase monoclonal (sc-377257, Santa Cruz Biotech-nology), sourit anti-p62 monoclonal (ab56416). ,Abcam), sourit anti- -aktin monoklonal (sc-47778; Santa Cruz Bio-teknoloji), lapen anti-LC3B poliklonal (#2775S; CST), sourit anti{- -syn (klonaj). 42) monoklonal (610786; BD Bio-syans, San Jose, CA, USA),anti-fosfo-treonin-argi-nine (#2351S, CST), anti-p53 (SC-99, Santa Cruz Biotechnology), anti-LaminB (SC-6216, Santa Cruz Biotech-nology), kabrit peroksidaz-konjige AffiniPure anti-sourit IgG(H plis L)(#115-035-003;Jackson Immunoresearch Labo-ratories Inc., West Grove, PA, USA), ak kabritperoksidaz-konjigeAffiniPure anti-lapen IgG(H plis L)(#1l1-035-144; Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.)antikò. Siyal imunoreactive nan manbràn nitrocellulose yo te devlope ak Luminata Crescendo Western HRP (#WBLUR0500, Merck & Co. Inc.,Kenilworth, NJ, USA), epi imaj yo te kaptire ak yon kamera MicroChemi4.2 (Shimadzu, Kyoto, Japon).

2.4.Proximity Ligation Assay (PLA) ak Immunofluorescence (IF).

PLA yo te fèt lè l sèvi avèk Duolink⑨ In Situ Detection Reagents Green (DUO{{0}}RXN, Sigma-Aldrich), DuolinkeIn in Situ PLA4Probe Anti-Mouse MINUS antikò (DUO{{{0}RXN, Sigma-Aldrich) , ak antikò Anti-Rabbit Plus (DUO92004-100RXN, Sigma-Aldrich), swiv enstriksyon manifakti a. Selil SH-SY5Y yo te simen nan 96-byen plak nwa (655077, Greiner Bio-One, Krems-münster, Otrich) yo te diferansye, epi selil yo diferansye yo te trete ak rotenone ak GSK-KI nan jou 7. Selil yo yo te rense de fwa ak glas-frèt Dulbecco a PBS(DPBS), fiks ak 4 pousan paraformaldehyde pou 30 min nan tanperati chanm (RT), epi rense twa fwa ak glas-frèt DPBS. Apre sa, selil yo te pèmeabilize lè l sèvi avèk 0.1 pousan Triton X-100 ki te prepare nan DPBS. Apre yo fin lave twa fwa ak DPBS frèt, selil yo te enkube ak yon gout solisyon bloke nan 37C pou 1h. Yo te retire solisyon bloke a, epi selil yo te enkube ak antikò (50μL) nan 37 degre pou 3h. Melanj anti-kò a te konpoze de yon diluan antikò ki soti nan twous la (antikò yo itilize pou PLA: antikò sourit anti-LRRK2 mono-klonal (1:20) ak lapen anti-LRRK2 fosfo-S1292 monoklonal (1:20) antikò; antikò itilize pou tès IF la: poul anti- -gal poliklonal antikò (1:400, ab9361, Abcam)).Nan tès IF la, yo te ajoute antikò a pandan tout pwosesis la jiskaske etap aplikasyon PLA. Lè sa a, echantiyon yo te lave de fwa ak 1x lave tanpon A pou 5min. Pou prepare solisyon an pwofonde, Duolink⑧In Situ PLA· Probe Anti-Mouse Minus ak Anti-Rabbit Plus yo te melanje ak diluant nan antikò (1:5). Pou tès IF la, yo te ajoute antikò anti- -gal la (1:400) nan melanj lan. Selil yo te enkube ak 50μL solisyon ankèt la nan 37C pou 1h. Apre sa, selil yo te lave de fwa ak lx lave tanpon A pou 5min. Pou tès IF la, ligase (40:1) ak anti- -gal antikò (400:1) yo te melanje nan tanpon ligasyon an. Selil yo te enkube ak solisyon ligasyon an (50μL) nan 37 degre pou 30min epi lave de fwa ak tanpon lx lave A pou 5min. Pou tès IF la,polymerase(1:40)yo te enkube ak Goat Anti-Chicken IgY H plis L(Alexa Fluor② 594; ab150172)segondè antikò (1:500)pou 100min nan 37C. Selil yo te lave de fwa ak 1x tanpon lave B pou 10 min, ki te swiv pa lave ak 0.01x tanpon lave B pou 1min. Pou tach nwayo a, selil yo te enkube ak Hoechst 33342 (1:1000;62249, Thermo Fisher Scientific) prepare nan DPBS nan RT pou 10min. Imaj selil yo nan 96-plak nwa yo te kaptire avèk yon mikwoskòp lazè konfokal (LSM 700, Carl Zeiss Jena, Almay).

2.5.Imunopresipitasyon.

Lysates tout selil yo nan dSHcells trete ak rotenone (1 μM) ak GSK-KI (1 uM) yo te prepare lè l sèvi avèk solisyon liz (PBS, 1 pousan Triton X-100, 1x bwason inhibitor pwoteaz, ak lx fosfataz). bwason inhibitor). Lysates yo te santrifuje nan 4,000g ak 4 degre pou 5min, epi yo te enkube supernatant la ak antikò anti-p53 (554293, BD Biosciences) ak PierceProtein G Aga-rose (20398, Thermo Fisher Scientific) resespann nan solisyon liz la pou 12 èdtan. Pèl yo te lave de fwa ak solisyon lysis la, epi konplèks pèl-pwoteyin te denatire ak tanpon echantiyon lx.

2.6. Fraksyon nikleyè.

Yo te izole fraksyon nikleyè lè l sèvi avèk NE-PERr Nikleyè ak Sitoplasmik Reyaktif Ekstraksyon (78833, Thermo Fisher Scientific), swiv enstriksyon manifakti a.

2.7. Preparasyon mRNA ak reyaksyon chèn polymerase an tan reyèl (qRT-PCR).

mRNA te izole nan rotenone/GSK-KI-trete selil dSH lè l sèvi avèk RNeasy Plus Mini kit la (74134, QIAGEN, Hilden, Almay). Apre sa, mRNA te ranvèse transkri nan ADN konplemantè (cDNA) lè l sèvi avèk TOPscript cDNA sentèz Twous la (EZ005S, Enzynomics, Daejeon, Repiblik Kore di). ROX, UDG plus)(RT500M, Enzynomics) Yo te itilize primè sa yo pou qRT-PCR: moun p21,5'-ATG AAA TTC ACC CCC TTT CC-3'(pi devan)) ak 5'-CCC TAG GCT GTG CTC ACT TC-3'(ranvèse); moun p16INK4(p16),5'-CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC-3'(pi devan) ak 5'-CAC GGG TCG GGT GAG AGT -3'(reverse).qRT-PCR te fèt sou Mic qPCR cycler (MIC-4,BioMolecular Systems,Upper Coomera, Ostrali).

2.8. Mezi Aktivite Galactosidase (-Gal) Asosye Senesans (SA), Espès Oksijèn Reyaktif (ROS), ak Aktivite Lyzosome.

Nan 30min apre tretman an, selil dSH vivan yo te tache ak 2μM GlycoGREEN-Gal (GC611, Goryo Chemical Inc., Hokkaido, Japon), 5uM 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFDA; 287810, Calbio-chem, San Diego, CA, USA）,2μM LysoSensorm Blue DND-167 (L7533, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ak 1μM Hoechst 33342 pou egzamine aktivite SA -gal, ROS, lizozom aktif, ak nwayo, respektivman. Selil yo tache yo te te monte ak ProLongDiamond Antifade Mountant (P36965, Invitrogen) ak imaj ak yon mikwoskòp konfokal lazè optik. Yo te jwenn imaj kontras entèferans diferans lè l sèvi avèk yon mikwoskòp lazè konfokal. {21}}twos tès senesans byen selilè (CBA-213, Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA), swiv enstriksyon manifakti a.

2.10.Manyen sourit ak Administrasyon Medikaman.

Sourit yo te okipe jan sa dekri deja [18] dapre direktiv Komite Etik Animal Dankook (Dankook IACUC, 18-026). .75 mg/kg pwa kò) ak MLi-2 (yon inibitè kinaz LRRK2; 1mg/kg pwa kò) yon fwa chak de jou pandan de semèn.

2.11.Tès Rotarod ak Preparasyon tisi nan sèvo.

Nan jou 14 apre tretman an, sourit yo te mete sou yon baton ki gen fòm silenn ki ka vire. Tan ki nesesè pou tonbe atè a te anrejistre. Detay yo nan tès la rotarod yo dekri yon lòt kote [18]. Apre sa, sourit yo te euthanized ak transcardially perfused ak glas-frèt HBSS ki gen Ca2 ak Mg. Te midbrain a disseke ak mikwo sizo ak pensèt. Tisi yo te lysed nan PBS ki gen 1 pousan Triton X -100, 1xXpert Protease Inhibitor Cocktail Solution (P3100, GenDEPOT, Katy, TX, USA), ak lx Xpert Phosphatase Inhibitor Cocktail Solution (P3200, GenDEPOT). Echantiyon yo te homogenized lè l sèvi avèk yon Pellet Pestle Cordless Motor (Sigma-Aldrich). Supernatant la te sibi Western blotting, SA -gal aktivite esè, ak anzim-lye tès imunosorbent (ELISA).

2.12.ELISA pou Oligomeric -Syn.

Anvan sa, nou te etabli yon sandwich ELISA pou analiz fibrillar -syn oligomèr lè l sèvi avèk yon antikò ki rekonèt konfòmasyon filaman nan -syn total [17]. Lysates midbrain brit yo te sibi ELISA, ak total -syn yo te quantifye lè l sèvi avèk estanda fibril -syn.

2.13. Imaj ak analiz done.

Entansite PLA ak tach selil vivan yo te mezire lè l sèvi avèk Zen 2012 (Carl Zeiss). Densitometry nan pwoteyin sib yo te fèt lè l sèvi avèk

Figi 1: Aktivasyon LRRK2 kinaz Rotenone-induit ankouraje senesans selilè nan liy selil différenciés neuroblastoma imen an. Western blotting analiz de selil dSH trete ak 1 uM rotenone oswa 1 uM GSK2578215A (GSK-K), yon inibitè kinaz LRRK2, pou 48 èdtan lè l sèvi avèk antikò kont pwoteyin sib yo (a). Dansite pwoteyin yo te nòmalize ak sa yo ki nan -actin (bg).n =3.(h) selil dSH trete ak 1 uM rotenone oswa 1uM GSK-KI pou 48h yo te sibi tès ligasyon pwoksimite (PLA) nan fosfo-S1292 LRRK2 ak total IRRK2(PIA-pS1292) ak analiz imunofluorescence (TF) nan -galactosidase, Nuclei te tache ak Hoechst 33342.Kontwòl yo itilize nan PLA ak IF tach revele validite rezilta yo (dwa de panno). Entansite PLA-pS1292(i) ak -galactosidase (j) yo te nòmalize nan 4',6-diamidino-2-phenylindole.n= 4; kantite selil= 12-17.

Multi Gauge (Fujilm, Tokyo, Japon). Tout seri done yo te analize ak grafik lè l sèvi avèk Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Done ki soti nan eksperyans ki fèt lè l sèvi avèk selil dSH ak newòn kortik prensipal rat yo te analize lè l sèvi avèk analiz de-fason. nan divèjans (ANOVA), ki te swiv pa tès post hoc Bonferroni a (n=3). Pandan se tan,the data obtained from mouse experiments, live-cell stain-ing,and PLA in the dSH cells were analyzed using two-way ANOVA, followed by Tukey's post hoc test (n>3). Tout done yo reprezante kòm mwayen ± erè estanda nan mwayèn. *p<><><><0.0001,and n.s.="not">

Figi 2: Inibitè LRRK kinaz inibit aktivasyon p53 nan liy selil différenciés neuroblastoma imen an. (a) Lysates tout-selil (20 pousan), ki te itilize kòm opinyon imunoprecipitation (IP), ak fraksyon nikleyè yo te kolekte. Analiz la revele ke 20 pousan opinyon ekspoze rezilta ki sanble ak sa yo obsève nan Figi 1. (b, c) echantiyon IP yo te denatire ak sibi Western blotting. Nivo fosforilasyon sit TXR yo nan p53 yo te nòmalize nan nivo total p53 yo. n=3.(de)Nivo total p53 nan nuceus la te egzamine lè l sèvi avèk Western blotting. LaminB te itilize pou nòmalizasyon nivo nikleyè p53. n=3.(f) Nivo mRNA p21 ak pl6 nan gwoup tretman an te nòmalize ak sa yo nan gwoup trete machin-(dimethyl sulfoxide-), n =3.

Atik sa a soti nan Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volim 2021, Atik ID 9969842, 16 paj https://doi.org/10.1155/2021/9969842