Analiz Metabolomik ki baze sou RMN pou efè sipleman -Ketoglutarate sou myoblast C2C12 nan diferan eta enèji.

Klike la a pou jwenn Cistanche Sipleman Anti-aje ak soulajman fatig

1. Entwodiksyon

Misk skelèt la se pi gwo ògàn nan kò imen an epi li kenbe aktivite nòmal lavi yo.Fòmasyon fè egzèsis ki dire lontanoswa patolojikl pwosesis nan maladi pwovoke domaj nan miskoswarezèv enèji nan misk ensifizan, nan moman sa a, restorasyon nan fòs nan misk ak fonksyon se patikilyèman enpòtan. Plizyè sipleman nitrisyonèl yo te anplwaye pou ankouraje ipètrofi misk skelèt ak amelyore pèfòmans espò [1]. Kòm entèseksyon nan metabolis kabòn òganik ak nitwojèn ak ansanm yon entèmedyè kritik nan sik la TCA, -Ketoglutarate (AKG) te montre efè pleyotropic pou amelyore pèfòmans nan misk nan eksperyans klinik ak bèt [2-9]. Pou egzanp, AKG ka diminye domaj nan mukoz entesten [8] ak enflamasyon [9], diminyedevlopman kansè kolorektal[4] ak fibwoz fwa [5], ankouraje kwasans [6], epi redwi morbidite akreta aje[7]. Travay anvan yo te demontre ke sipleman AKG ka soulaje pèt nan misk pa administrasyon parenteral nan yon modèl chòk nan pasyan ki sibi ranplasman total anch [2], epi ankouraje ipètrofi misk ak sentèz pwoteyin atravè chemen siyal Akt / mTOR [10,11]. Nan ka distwofi miskilè Duchenne, sipleman AKG ka anpeche atrofi nan misk ak malfonksyònman atravè chemen PHD3/ADRB 2-medyatè [12]. Travay anvan nou an te montre tou ke sipleman AKG ka pwofondman fasilite pwopagasyon C2C12 myoblasts, ak soulaje atrofi myotubes C2C12 kiltive nan yon mwayen san glikoz [13]. Etandone ke glikoz se sous prensipal enèji pou kenbe fonksyon nòmal fizyolojik nan misk skelèt, efè sipleman AKG pou amelyore pèfòmans nan misk yo depann anpil sou nivo glikoz nan misk skelèt. Diferans ki genyen nan efè AKG-pwovoke nan misk skelèt ant diferan eta enèji yo klè.

AKG patisipe nan sentèz asid amine, vitamin, akasid òganikepimetabolis enèjinan kò a, ki enplike konvèsyon an nan AKG nan glutamate pa glutamate dehydrogenase, ak amidasyon an ki vin apre nan glutamate ak amonyak pa glutamin sentetaz. AKG bay enèji pou kwasans selil atravè sik TCA ak fosforilasyon oksidatif epi li fè pwomosyon metabolis selilè ak siyal lè li kominike avèk reseptè OXGR li yo (yon reseptè G pwoteyin ki makonnen) sou manbràn selilè a [14,15]. Anplis, AKG ka kontwole metabolis oksidatif mitokondriyo ak ankouraje eta epigenetik toleran lè li medyatè tranzisyon eta selil anbriyon bonè ak devlopman selil jèm [16]. Anplis de sa, AKG fè egzèsis ka ankouraje reseptè OXGR1 li yo nan glann adrenal yo pou kontwole tèrmojenèz ak dekonpozisyon trigliserid nan tisi adipoz epi pwodui efè benefik sou metabolis [17].

Sepandan, kèk etid yo te fèt pou revele AKG-induit chanjman metabolik nan misk skelèt nan diferan eta enèji ak mekanis metabolik ki kache yo. Dènyèman, analiz metabolomik yo te anplwaye pou sistematikman klarifye mekanis molekilè ki kache efè benefisye sipleman nitrisyonèl yo. Altènasyon nan metabolit aji kòm pwodwi yo en nan transkripsyon jèn yo ka reflete chanjman metabolik an jeneral entwitif. Kòm teknik patikilyèman apwopriye pou quantitatively detekte chanjman nan nivo metabolit nan biofluids, tisi, ak selil, gwo rezolisyon, 1H nikleyè rezonans mayetik (NMR) spèktroskopi te aplike anpil nan analiz metabolomik. Siyifikativman, pwofil metabolomik ki baze sou NMR gen plizyè avantaj tankou repwodiksyon segondè, mezi quantitative san prejije, ak preparasyon echantiyon pratik [18,19]. Précédemment, nou te fè analiz metabolomik ki baze sou RMN pou eksplike tou de efè sipleman kreatin sou myoblast C2C12 [20], ak efè sipleman alanyl-glutamine sou myoblast blese pa privasyon enèji [21].

2. Rezilta

2.1. Pwoliferasyon ak diferansyasyon myoblast C2C12 ak sipleman AKG

Selil myoblast C2C12 kiltive nan yon mwayen kwasans nòmal ak ak san sipleman AKG yo te gwoupe kòm Nor-A ak Nor, tandiske sa yo ki nan mwayen kwasans ki ba glikoz ak oswa san sipleman AKG yo te gwoupe kòm Low-A ak Low. Konsiste ak etid anvan an [10], selil Nor-A ak sipleman AKG nan yon konsantrasyon 2 mm te montre yon rantabilite selil siyifikativman amelyore parapò ak selil Nor (Figi S1).

Se poutèt sa, yo te itilize konsantrasyon AKG nan 2 mm nan eksperyans yo pou evalye chanjman AKG-induit nan pwopagasyon ak diferansyasyon nan myoblasts. Konpare ak selil Nor, selil ki ba yo te montre yon pousantaj pwopagasyon pwofondman diminye akòz defisi enèji (Figi 1A). Menmsi sipleman AKG pa t lakòz mòfoloji siyifikativman diferan nan myoblasts nan de eta enèji yo, li non sèlman ogmante pousantaj pwopagasyon selil ki ba yo kiltive nan yon mwayen ki ba glikoz, men tou li te ogmante sa ki nan selil Nor ki kiltive nan yon mwayen nòmal. etid anvan yo [10,12]. Nimewo selil yo pou chak zòn bay yo te konte pou kat gwoup myoblast yo (n=4 pou gwoup la): Ni, 563.8 ± 10.4; Nor-A, 624.0 ± 10.8; Ba, 493.8 ± 14.5; Low A, 547.0 ± 11.7 (Figi 1B). Li se vo anyen ke selil Low-A pa t 'montre nimewo selil estatistik diferan soti nan selil Nor, ki endike ke sipleman AKG te kapab refè nimewo selil yo pou myoblast yo nan kondisyon kilti ba glikoz (Figi 1B).

Figi 1, Pwoliferasyon ak diferansyasyon kapasite C2C12 myoblasts anba kondisyon kilti nòmal ak ba. kilti glikoz. (A) Mòfoloji myoblasts. (B) Nimewo selil ki koresponn ak panèl A (n=4). (C) Vitabilite selil yo parapò ak selil Nor yo analize pa tès pwopagasyon selil MTS (n=5). (D) ekspresyon MyoD1 nan myoblasts analize pa Western blot. Yo te itilize antikò anti-GAPDH pou estandadize kantite pwoteyin nan chak liy. (E) Analiz estatistik ki koresponn ak panno yo (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.

Anplis de sa, yo te fè tès MTS la pou konpare pousantaj pwopagasyon kat gwoup selil yo (Figi 1C). Selil ki ba yo te gen yon to pwopagasyon klèman diminye konpare ak selil Nor, sa ki endike ke mwayen ki ba-glikoz defavorize pwopagasyon selil yo. Siyifikativman, sipleman AKG ogmante pousantaj pwopagasyon selil Nor-A ak Low-A relatif a selil Nor ak Low, respektivman. Remake byen ke selil Low-A yo te montre yon kapasite pwopagasyon pi ba pase selil Nor, sa ki vle di ke sipleman AKG sèlman pasyèlman retabli pwopagasyon selil ki kiltive nan yon mwayen ki ba glikoz.

.Ekspresyon diferansyasyon myogenic 1 (MyoD1) pwoteyin anjeneral yo itilize pou karakterize kapasite diferansyasyon selil yo. Se konsa, nou te konpare kantite ekspresyon MyoD1 ant kat gwoup selil yo (Figi 1D). Selil ki ba yo te montre yon kapasite diferansyasyon pwofondman te refize konpare ak selil Nor yo. Siyifikativman, AKGsupplementation moute-reglemante kapasite diferansyasyon nan selil kiltive tou de nan mwayen nòmal ak nan mwayen ki ba-glikoz, jan sa endike nan apeprè yon ogmantasyon 30 pousan nan MyoD1expression nan Nor-A ak Low-A selil yo. Miyò, selil Low-A yo pa montre ekspresyon MyoD1 estatistik siyifikativman diferan de selil Nor yo, sa ki vle di efikasite segondè nan sipleman AKG pou restore kapasite diferansyasyon selil ki kiltive nan yon mwayen ki ba glikoz.

Anplis de sa, nou analize kapasite diferansyasyon myotube pou kat gwoup myoblast C2C12 yo. Myotubes yo te fòme atravè fizyon myoblasts kiltive nan medya diferansyasyon nòmal ak ba-glikoz avèk oswa san sipleman AKG Figi S3). Mòfoloji nan myotubes C2C12 yo te montre ke kilti ki ba-glikoz afekte kapasite nan diferansyasyon myotube nan selil yo, ak sipleman AKG te kapab ankouraje diferansyasyon myotube nan myoblast kiltive tou de nan yon mwayen nòmal ak nan yon mwayen ow-glikoz.

2.2. RMN Spectra ofAqueous èkstre nan myoblast C2C12

Tipik 850 MHz 1H NMR spectre yo te anrejistre sou ekstrè akeuz ki sòti nan gwoup Nor, Nor-A, Low, ak Low-A nan myoblasts C2C12 (Figi 2A). Yon total de 34 metabolit yo te asiyen ak rezime nan Tablo S1. Yo te konfime plasman sonorite metabolit yo lè l sèvi avèk espèk 2D 1H-13C HSOC ak 1H-H TOCSY (Figi S4 ak S5). Enspeksyon vizyèl nan espèk NMR yo endike ke kilti myoblasts ak sipleman AKG te lakòz akimilasyon enpòtan nan intracellularAKG nan selil Nor-A ak Low-A (Figi 2B).

Figi 2, Mwayèn 850 MHz lH spectre sonorite mayetik nikleyè (NMR) anrejistre sou ekstrè akeuz ki sòti nan gwoup Nor, Nor-A, Low, ak Low-A nan myoblasts C2C12. (A) Konparezon mwayèn NMR spectre kat gwoup yo. Echèl vètikal yo te kenbe konstan nan tout espèk lH RMN yo. Rejyon dlo a (4.7-5.2 ppm) te retire(B) Rejyon lokal anplifye nan pik a-Ketoglutarate (AKG). Liy ble/vèt/jòn/wouj: rejyon espèk ki soti nan gwoup Nor/Nor-A/Low/Low-A. AKG, a-ketoglutarate; PC, O-fosfokolin; GPC, sn-glycero-3-phosphocholineUDP-glikoz, Uridine difosfat glikoz: CTP, sn-glycero-3-fosfokolin; NAD plis, nikotinamid adenine dinukleotid AXP adenine mono /di /trifosfat.

2.3. Analiz done miltivarye pou eksplore pwofil metabolik selilè

Nou te fè plis analiz done miltivarye sou done espèk NMR pou pwofil metabolik kat gwoup myoblast C2C12 yo. Nou te premye etabli twa modèl PCA san sipèvizyon ak de premye konpozan yo (PC1, PC2) apèsi sou tandans gwoupman yo ak revele diferans metabolik ant gwoup yo nan myoblasts. Konplo nòt ThePCA yo montre ke pwofil metabolik selil ki kiltive nan yon mwayen ki ba-glikoz te byen distenge ak sa ki kiltive nan yon mwayen nòmal (Figi 3A), ak AKCsupplementation siyifikativman chanje modèl metabolik selil yo kiltive tou de nan yon mwayen nòmal ak nan mwayen ki ba glikoz (Figi 3B, C). Sepandan, diferans metabolik ant gwoup Nor-A ak Nor te pi gwo pase sa ant gwoup Low-A ak Low, sa vle di efè sipleman AKG sou pwofil metabolik myoblast yo depann anpil de eta enèji selil yo.

Figi 3. Analiz miltivarye pou 'HNMR spectre yo te anrejistre sou ekstrè akeuz ki sòti nan myoblast C2C12 nan gwoup Nor, Nor-A, Low, ak Low-A. (AC) PCA fè nòt gwoup Low-A ak Nor yo, Low-A ak Low gwoup Nor-A ak Nor; (DF) OPIS-DA bay nòt gwoup Low ak Nor (R2: 0.999, 02: 0.996), gwoup Low-A ak Low (R2: 0.918: 02: 0.761), gwoup Nor-A ak Nor (R2: 0.927: 02: 0.838). Elips yo endike limit konfyans 95 pousan.

Anplis de sa, nou te etabli twa modèl OPLS-DA sipèvize pou ilistre separasyon metabolik ant kat gwoup myoblasts (Figi 3D-F). Kòm espere, modèl OPLSDA yo maksimize distenksyon metabolik ant kat gwoup yo lè yo rezève enfòmasyon varyab orthogonal ki gen rapò ak filtre enfòmasyon varyab orthogonal ki pa korel. Anplis de sa, nou te fè tès pèmitasyon o aza (n=200) pou evalye fyab modèl OPLS-DA yo (Figi S6), ki endike validite modèl OPLS-DA etabli yo.

2.4. Idantifikasyon metabolit diferans ak enpòtan

Pou konpare quantitatively nivo metabolit ant kat gwoup C2C12 myoblasts, nou kalkile nivo relatif yo nan metabolit yo idantifye ki baze sou entegral relatif yo (Tablo S2). Sipleman AKG dramatikman ogmante nivo intracellularAKG nan gwoup Nor-A ak Low-A men pa t chanje siyifikativman sa ki nan gwoup Nor ak Low. Nou te fè tès t Student pou idantifye metabolit diferans ak yon kritè p < 0.05 (Figi 4). Konparezon Nor vs Low idantifye 29 metabolit diferans (Figi 4A), ki gen ladan 18 metabolit amelyore (lesin, izoleucin, valin, acetate, glutamate, glutamin, methionine, aspartate, lizin, kreatin, PC (O-fosfokolin) taurin, tirozin. , phenylalanine, histidine, NAD plis , fòma, AXP), ak 11 te refize Metabo. Lit (glutatyon, piroglutamat, fosfokreatin, beta-alanin, GPC, glikoz, glisin, acetate, treonin, GTP, UDP-glikoz). Konparezon nan Low-A vs Low-Idantifye metabolit diferans (Figi 4B), ki gen ladan 7 metabolit ogmante (etanòl, AKGbeta-alanine, PC, taurine, glisin, ak GTP) ak 3 metabolit diminye (glutamin, lizin ak myoinositol). Konparezon Nor-A ak Nor te idantifye 18 metabolit diferans (Figi 4C), ki gen ladan 6 metabolit regilasyon (AKG, pyroglutamate, glutamin, lizin, glikoz, laktat), ak 12 metabolit anba reglemante (alanin, acetate, glutatyon). methionine, fosfokreatin, PC, myoinositol, glisin, treonin, GTP, UDP-glikoz, ak AXP).

Figi 4. Entansite relatif nan metabolit diferans yo te idantifye nan konparezon par ant kat gwoup yo nan C2C12 myoblasts. (A) Low vs Ni; (B) Low-A vs Low; (C) Nor-A kont Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.n { {13}} pou chak gwoup.

Anplis de sa, nou te itilize modèl OPLS-DA yo pou idantifye metabolit enpòtan ak yon kritè VIP> 1 (Figi 5). Totalman, 12, 10, ak 10 metabolit enpòtan yo te idantifye nan modèl OPLS-DA yo nan Nor-A vs Nor, Nor vs Low, Low-A vs Low.

Figi 5. Nòt VIP metabolit enpòtan yo te idantifye nan konparezon par ant kat gwoup C2C12myoblasts yo. (A) Low vs Ni; (B) Low-A vs Low; (C) Nor-A kont Nor. Polis Wouj/Ble vle di ogmante/diminye nivo metabolit la.

Konbinezon metabolit enpòtan yo idantifye ak metabolit diferans yo te bay metabolit karakteristik (Tablo 1). Konparezon par yo nan Low vs Nor, Low-A vs Low, ak Nor-A vs Nor idantifye 10, 6, ak 10 metabolit karakteristik, respektivman, ki endike ke efè sipleman AKG sou myoblast yo te asosye byen ak enèji a. eta selil yo.

2.5. Idantifikasyon Metabolik Siyifikativman Chanje

Pathways Nou te fè analiz metabolik chemen pou idantifye siyifikativman chanje chemen metabolik (chemen enpòtan) ki baze sou nivo metabolit yo te idantifye nan konparezon par yo ant kat gwoup C1C12 myoblasts (Figi S7; Tablo 2 ak Tablo S3). Analiz Nor vs Low te idantifye 11 wout enpòtan: (1) Alanine, aspartate, ak metabolis glutamat; (2) Glisin, serin, ak treonin metabolis; (3) Glutathione metabolis; (4) D-Glutamine ak D-glutamate metabolis; (5) Amidon ak sikwoz metabolis; (6) metabolis beta-Alanine; (7) Taurin ak hypotaurine metabolis; (8) metabolis fenilalanin; (9) Biosentèz fenilalanin, tirozin ak triptofan; (10) Nikotinat ak metabolis nikotinamid; (11) Metabol histidin. Chemen siyifikatif sa a te asosye ak metabolis enèji, estrès oksidatif, ak sik TCA anapleroz fllux.

Analiz Nor-A vs Nor sèlman te idantifye senk premye chemen enpòtan 1–5 eksepte lòt sis chemen 6–11 yo. Yon lòt jan, analiz Low-A vs Low sèlman idantifye sis chemen enpòtan: premye kat chemen 1-4 yo pataje pa konparezon Low vs. Nor, Nor-A vs. de chemen 6-7 pataje pa konparezon Low vs. Remake byen ke sipleman AKG pa t 'siyifikativman chanje chemen 5 (Amidon ak metabolis sikwoz) nan selil kiltive nan yon mwayen ki ba-glikoz, men entèfere ak de lòt wout (metabol beta-Alanine ak metabolis taurin ak hypotaurine). Pou vizyalize chanjman AKG-pwovoke nan metabolit karakteristik yo, nou pwojte metabolit sa yo sou yon kat metabolik ki baze sou baz done Kyoto Ansiklopedi Jèn ak Genòm (KEGG) (Figi 6). KEGG te itilize anpil kòm youn nan resous done prensipal yo pou rekonstwi rezo metabolik yo epi mete aksan sou wout metabolik enpòtan yo. Tou de metabolit karakteristik ki chanje yo ak siyifikativman chanje chemen metabolik bay nouvo apèsi sou mekanis molekilè ki kache efè sipleman AKG sou myoblast C2C12.