Parazit, Enfeksyon, Ak Vaksinasyon nan Selil Minimal Sentetik

REZIME: Selil minimòm sentetik bay yon modèl kontwole ak enjenieri pou pwosesis byolojik. Pandan ke yo pi senp pase nenpòt selil natirèl vivan, selil sentetik yo ofri yon chasi pou envestige fondasyon chimik yo nan pwosesis byolojik kle yo. Nan la a, nou montre yon sistèm selil sentetik ak selil lame, kominike avèk parazit ak sibi enfeksyon nan divès severite. Nou demontre ki jan lame a ka enjenyè pou reziste kont enfeksyon, nou mennen ankèt sou pri metabolik pou pote rezistans, epi nou montre yon inokulasyon ki iminize lame a kont patojèn. Travay nou an elaji bwat zouti jeni selil sentetik nan demontre entèraksyon lame-patojèn ak mekanis pou jwenn iminite. Sa a pote sistèm selil sentetik yon etap pi pre bay yon modèl konplè nan konplèks, lavi natirèl.

benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè

ENTWODIKSYON

Nan plizyè deseni ki sot pase yo, jaden an nan byoloji sentetik te eksploze, sa ki pèmèt pou konstriksyon an nan selil sentetik ki sanble ak modèl aspè nan lavi natirèl byolojik. Modélisation chemen selilè ak konpòtman nan selil sentetik ofri anpil avantaj sou selil vivan yo tankou yon anviwònman reyaksyon ki pi senplifye ak defini, kontwòl konplè sou makiyaj pwoteomik ak chimik selil la, kapasite nan konpatimantasyon entèferans chemen byolojik ak pwosesis, osi byen ke kenbe. sistèm byolojik enpòtan ki absan nan sistèm reyaksyon in vitro.1,2 Byen inik sa yo nan teknoloji selil sentetik te deja pèmèt pou simulation nan kondisyon byolojik ak chemen nan yon vi-tankou bioreactor in vitro (selil sentetik) epi yo te pote yon pi bon konpreyansyon nan. anpil domèn etid, ki gen ladan foul moun molekilè,3 dinamik lipid-pwoteyin,4 metabolis minim,5 ak anpil lòt aspè kritik nan lavi byolojik.2 Selil sentetik ki sanble ak lavi sa yo ak byen inik yo rapidman vin pi bon modèl epi koule plis limyè nan fonksyònman misterye enteryè lavi selilè yo.6,7 Dekouvèt sa yo pa limite nan pwosesis sèlil; entèraksyon jeni ant popilasyon lipozom yo te pwouve yon teknoloji pwisan tou. Pou egzanp, konsepsyon yon sistèm selilè sentetik ki imite yon relasyon predatè-pwa yo te devlope lè l sèvi avèk limyè kòm siyal ant popilasyon selil sentetik sa yo.8 Yo te devlope yon lòt travay konplèks ki pèmèt pwopagasyon siyal atravè yon matris ti gout selil sentetik, pèmèt fliyoresans gaye nan yon fason espasyal nan mitan popilasyon an.9 Anplis entèraksyon selil sentetik-selil sentetik, te gen avansman resan nan koòdone sentetik selil vivan tou. Pou egzanp, li te montre ke yon selil sentetik ki fèt pou koòdone ak yon selil souch neral kapab pwovoke diferansyasyon neral epi tou li aji kòm yon chasi jeneralize ki kapab entèfas ak lòt kalite selil.10 Te gen anpil pwogrè nan devlopman an. pwopagasyon siyal ak selil sentetik ki aji kòm koòdone, anpil ladan yo eksplore nan revizyon sa yo.11−13 An brèf, gen tout domèn rechèch ki konsène imite entèraksyon popilasyon selilè nan sistèm modèl selil sentetik yo. Malgre sa, pa te gen yon etid ki itilize selil sentetik pou modèl enfeksyon, parazit, oswa vaksinasyon. Menm jan selil sentetik yo souvan itilize pou modèl pwosesis byolojik konplèks nan yon fason senplifye ak kontwole, potansyèl la egziste pou kapab modle entèraksyon entè-òganis konplèks sa yo. Enpòtans sa a ka wè nan etid inogirasyon an ki te pwodwi avèk siksè patikil faj aktif nan yon platfòm ekspresyon pwoteyin san selil. genomic yon selil hôte, menm jan viris ak parazit vivan yo fè sa. Lè ou kapab aplike ak enjenyè selil sentetik pou modèl konpòtman maladi sa yo pral bay yon zouti valab pou kominote syantifik la.

Nan travay sa a, nou montre sistèm nou an pou modèl maladi selil sentetik. Nou te kreye yon selil lame ki ta ka sibi enfeksyon nan dezyèm popilasyon an nan selil parazit sentetik ak envestige konpetisyon an resous, detounman genomic, ak repurposing metabolik ki rive pandan yon enfeksyon konsa. Nou menm tou nou modèl yon metòd ki pèmèt pou sekou lame a apre enfeksyon ak yon mwayen pou vaksinasyon ki pral pèmèt pou lame a reziste kont enfeksyon nan selil sentetik maladi ki lakòz. Nan ti bout tan, nou prezante yon nouvo maladi ak enfeksyon modèl chasi pou selil sentetik. Avèk teknoloji sa a, selil sentetik yo ka kòmanse itilize kòm modèl rudimantè pou maladi, enfeksyon, ak vaksinasyon (Figi 1).

Figi 1. Parazit, enfeksyon, ak sistèm inokulasyon nan selil minim sentetik. (a) "Lame a" se yon selil sentetik ki eksprime pwoteyin fliyoresan vèt (GFP). Sou sifas manbràn ekstèn lan, lame a pote etikèt ssDNA. Pwoteyin yo sèlman tradui nan yon lame an sante se pwòp pwoteyin lame a ki soti nan plasmid yo te kreye lame a. (b) "Parazit la" se yon lipozom ki ranpli ak ADN plasmid ki kode yon jèn pou pwoteyin fliyoresan mCherry, epi sifas lipozom parazit la dekore avèk tag ssDNA (konplemantè ak tag sou sifas lame a). "Enfeksyon an" kòmanse ak yon fizyon nan lame a ak lipozom parazit, medyatè pa etikèt yo ADN konplemantè sou sifas yo. Apre enfeksyon an, lame a eksprime jèn orijinal lame (GFP) ak jèn parazit (mCherry). (c) "Enfeksyon an" kòmanse ak lipozom "patojèn" ki pote yon jèn pou anzim restriksyon MunI ki fusion ak lipozom lame yo. Jèn patojèn MunI eksprime pa lame a ak anzim restriksyon MunI dijere ADN lame. Sa a rezilta nan genomic lame natif natal yo te dijere, vire pi fò nan ekspresyon an pwoteyin lame soti nan GFP nan pwoteyin patojèn nan kode, MunI. (d) "Enfeksyon letal la" se yon fizyon nan lipozom lame a (ak genòm GFP) ak lipozom patojèn ki gen jèn ki kode aHL, yon pwoteyin manbràn. Apre enfeksyon an, lame a eksprime aHL, ki kreye porositë manbràn, sa ki lakòz flit nan eleman nitritif lame ak efektivman fèmen metabolis lame a. (e) "Vaksinasyon" se enkubasyon lame a ak ssDNA ki gen yon sekans konpatib ak fizyon tags sou sifas liposomes lame yo. ADN vaksinasyon an kreye yon duplex ak tags ADN lame, anpeche ibridasyon lòt oligos ADN ak tags sa yo. Sa a anpeche fizyon an nan nenpòt lipozom patojèn nan lame a. Sa a se yon figi prèv-de-konsèp, ak graf yo se pou rezon ilistrasyon, ki reprezante kantite relatif nan pwoteyin eksprime nan lame a ak divès kalite patojèn. Done reyèl pou chak sistèm yo bay nan figi ki vin apre yo.

REZILTA AK DISKISYON

Nan travay sa a, nou itilize mo yo: lame, parazit, enfeksyon, ki ka touye moun, vaksen, ak vaksinasyon tout nan kontèks sistèm selil ki pa vivan, sentetik. Pa "mòtèl" enfeksyon, nou vle di yon diminisyon make nan tradiksyon nan popilasyon an nan selil sentetik. Tout eksperyans nan travay sa a te fèt sou selil sentetik ki pa vivan, ki pa replike tèt yo, epi ki pa evolye. Sa a se yon sistèm modèl pou pwopriyete natirèl byolojik ak pwosesis.

benefis sipleman cistanche-ogmante iminite

Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity

【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Enfeksyon nan yon selil sentetik ak yon selil parazit sentetik detounen resous lame yo.

Pou teste konsèp nan yon sistèm selil sentetik imite yon enfeksyon, nou te kòmanse pa konstwi yon sistèm modèl pou yon parazit. Nou te itilize konsèp ki pi senp nan yon parazit posib pou rekonstitye nan sistèm byochimik ki pa vivan sa a: yon parazit ki detounen kèk nan resous lame a. Nan ka sa a, metabolis lame a reprezante pa ekspresyon pwoteyin GFP, epi parazit la reprezante pa ekspresyon pwoteyin mCherry. Pou sistèm sa a, nou te itilize fenomèn ki te demontre deja nan pwodiksyon ekspresyon lineyè pwoteyin ki depann de konsantrasyon modèl ADN nan TxTl.15,16 Premyèman, nou te deside jwenn pi bon konsantrasyon total plasmid nan ki rapò GFP ak ADN mCherry koresponn ak. rapò a nan fluoresans obsève soti nan pwoteyin sa yo. Nou abitrèman asiyen jèn GFP kòm "lame" ak jèn mCherry kòm "parazit". Non sa yo pa vle di anyen espesyal nan eksperyans patikilye sa a men yo pral endike lame a ak parazit nan eksperyans selil sentetik ki vin apre yo. Isit la, nou itilize non sa yo pou rann li pi fasil pou gen rapò eksperyans sa yo prèv konsèp ak eksperyans ki vin apre enfeksyon selil sentetik lè l sèvi avèk menm plasmid yo. Nou melanje plasmid GFP ak mCherry, ak tou de jèn ki anba kontwòl pwomotè T7 nan diferan rapò plasmid ak yon konsantrasyon total plasmid nan echantiyon yo 1, 5, 10, oswa 15 nM (Figi 2b). Rezilta yo te swiv relasyon espere prèske lineyè ant konsantrasyon nan plasmid ak entansite fliyoresan ki anrejistre a, ak pi bon match ant fliyoresans ak rapò konsantrasyon plasmid yo obsève nan yon total de 10 nM plasmid. Relasyon obsève yo endike plasmid yo, ak pwoteyin yo menm jan an gwosè ak konpozisyon asid amine (Figi S1), konpetisyon pou menm pisin resous TxTl pou ekspresyon yo. Chanje konsantrasyon relatif de plasmid yo lakòz chanjman nan efikasite ekspresyon apeprè pwopòsyonèl ak rapò plasmid yo. Sa a endike ke li ta yon bon modèl imite enfeksyon parazit: genomic parazit la (mCherry plasmid) pral konpetisyon ak genòm lame a (GFP plasmid). Apre sa, nou deside teste yon ka kote youn nan plasmid yo te anba kontwòl yon pwomotè ki pi fò, kidonk imite yon senaryo alokasyon resous partial. Pou kenbe aspè konpetisyon resous nan fiti "parazit" eksperyans enfeksyon, nou te kenbe tou de jèn anba menm pwomotè RNA polymerase (T7 RNA polymerase, T7 RNAP) men varye fòs li yo. Nou te itilize yon T7 RNAP pwomotè fò T7Max, ki demontre siyifikativman pi wo rannman transkripsyon, sa ki lakòz korespondan pi wo pwodiksyon tradiksyon, nan TxTl. konsantrasyon plasmid. Youn nan plasmid yo te anba kontwòl pwomotè T7Max fò a, pandan ke lòt la te anba pwomotè T7 kanon. Nan tou de ka tès yo, ekspresyon plasmid T7Max la te fò ase ke fliyoresans pwoteyin ki soti nan yon jèn anba T7Max pa t ogmante anpil ak konsantrasyon total plasmid la ogmante (Figi 2c, 2d). Li pa t 'sanble gen pwoblèm si T7Max te kondwi GFP oswa mCherry, tou de pwoteyin reponn a pwomotè a pi fò ak yon ogmantasyon relatif menm jan an. Sa a te bay yon modèl pwomèt pou enfeksyon ak yon parazit "pi fò" (yon parazit ki pote jèn anba T7Max nan yon lame anba T7) ak ranvèse, pi fò lame reziste parazit pi fèb (yon lame ki gen genomic anba T7Max ak yon parazit ki pote jèn T7). Ankouraje pa eksperyans prèv prensip sa yo, nou te deplase sou eksperyans selil sentetik.

"Enfeksyon an," nan tout ka, se fizyon an nan yon lame ak parazit selil sentetik. Fizyon an fasilite pa etikèt ADN sou sifas lipozom yo, lè l sèvi avèk sistèm fizyon ADN-induzibl ki dekri anvan an.18 Yon ti tan, selil sentetik yo te kreye ak Escherichia coli TxTl andedan yon manbràn POPC ak kolestewòl, epi feyè deyò a te dekore. ak yon sèl ADN bloke ancrage nan manbràn nan pa modifikasyon kolestewòl. Si yon pè liposòm ak tags konplemantè rankontre, tags ADN yo ibrid, yo pote manbràn yo ansanm epi kòmanse fizyon manbràn, ki swiv pa melanje lumèn. Nan eksperyans nou yo, selil sentetik lame a se lipozom ki gen TxTl ak T7 RNAP anplis genomic yon GFP plasmid ki kode. Siveyans fluoresans GFP sèvi kòm yon prokurasyon pou "sante" metabolis lame a. Parazit kap vini an gen yon genomic nan fòm yon plasmid ki kode mCherry, sistèm tradiksyon konplè a, men pa gen T7 RNA polymerase. Sa a asire ke nenpòt chanjman obsève nan metabolis lame a soti nan jèn yo pote nan parazit la epi yo pa soti nan fizyon an nan parazit la ak lipozom lame, dilye sitoplasm lame a. Eksperyans enfeksyon parazit yo te pote soti ak manbràn lame ki make ak Marina Blue DHPE, yon lank lipid manbràn ble. Sa a te pèmèt nou nòmalize fluoresans lame obsève ak parazit jèn nan fluoresans ble a, nòmalize rezilta yo nan kantite total fluoresans manbràn lame prezan nan echantiyon an. Sa a kont pou dilusyon yo nan volim total echantiyon an apre adisyon a nan lipozom parazit. Manbràn parazit yo pa te make fluorescent. Tout eksperyans yo te akonpaye pa yon echantiyon kontwòl, kote sèlman yon popilasyon te prezan lame a, men ak plasmid mCherry, yo montre teyorik maksimòm nivo ekspresyon mCherry posib si li te jèn nan sèlman nan popilasyon an. Nan premye seri eksperyans, nou melanje lame a ak parazit ak jèn tou de anba kontwòl pwomotè T7 regilye a.kidonk tou de jèn lame ak parazit yo te egalman "fò." Nou melanje lame a ak parazit la pou parazit la te nan 25, 50, oswa 75% nan popilasyon total liposome. Nan tout ka yo, fliyoresans GFP lame a diminye nan prezans parazit la, ak ogmantasyon korespondan nan fliyoresans parazit mCherry (Figi 2e). Echantiyon ki gen sèlman parazit la epi ki pa gen okenn lame pa pwodui okenn fliyoresans nan swa koulè, jan yo espere. Nan tout ka, fizyon ADN-medyatè lipozom nan pa 100% efikas;18,19 Se poutèt sa, diminisyon relatif nan fliyoresans lame ak ogmantasyon nan fliyoresans parazit pa t 'tankou valè teyorik espere ki baze sou rapò a nan lame a parazit. Nan lòt mo, enfeksyon an pa t '100% efikas. Kalite sa a seredipitous nan sistèm fizyon ADN-induit la te, nan ka sa a, yon karakteristik benefisye nan sistèm nan. Kòm nan ka enfeksyon natirèl, enfeksyon selil sentetik fizyon-medyatè pa te afekte tout lame epi se pa tout parazit yo te jwenn yon lame. Apre sa, nou te envestige de ka, kote lame a ak parazit yo pa te egalman matche nan fòs nan jenom yo. Nan yon ka, genomic lame a te anba kontwòl pwomotè T7 la pandan y ap genomic parazit la te anba pwomotè T7Max (Figi 2f), ak nan senaryo opoze a, genomic lame a te anba T7Max ak genomic parazit te anba pwomotè T7. (Figi 2g). Nan ka a nan lame a pi fèb atake pa yon parazit pi fò, ogmantasyon relatif nan parazit mCherry fliyoresans ak diminisyon ki koresponn lan nan lame GFP fliyoresans te pi fò pase nan ka anvan an nan yon lame egalman matche ak parazit. Kòm espere, lè lame a te pi fò pase parazit la, opoze a te vre: nivo fliyoresan mCherry yo te pi ba ak diminisyon relatif nan fliyoresan GFP te pi ba pase nan ka a egalman egal. Sa a pi byen ilistre lè w konpare yon sèl pwen done anba menm kondisyon enfeksyon: nan 75% rapò parazit. Egalman matche ak popilasyon lame ak parazit rezilta nan yon fliyoresans parazit yon ti kras pi gwo pase lame a. Lè parazit la pi fò, fliyoresans parazit la siyifikativman pi wo pase lame a. Men, lè lame a pi fò, fliyoresans parazit la se yon ti kras pi ba pase lame a. Pwen done make sa yo make ak yon etwal jòn nan Figi 2e−g. Nou te fè eksperyans kontwòl yon lame ki enfekte ak yon parazit "senmptomatik" yon parazit ki pote yon plasmid ak pwomotè T7 men pa gen okenn sekans kodaj pwoteyin (nou retire kasèt mCherry nan plasmid la) (Figi 2h). Fliyoresans GFP lame a diminye yon ti kras nan pi wo nivo parazit, sa ki endike ke kèk ti kantite resous lame yo konsakre nan transkripsyon kout RNA ki pa kode soti nan plasmid parazit la. Done sa yo konfime tou ke fado metabolik prensipal enfeksyon parazit la sou lame a se nan itilize resous translasyonèl, pa transkripsyon. Obsèvasyon sa a tonbe nan liy ak obsèvasyon anvan yo nan tradiksyon ki se resous ki pi varyab ak limite nan sistèm san selil.20 An jeneral, eksperyans sa yo bay yon modèl pou enfeksyon ak yon parazit ki detounen resous metabolik lame a, ak konpòtman selil sentetik imite. aspè nan yon relasyon natirèl lame-parazit.

Figi 2. Enfeksyon parazit detounen resous lame a. (a) Lipozom selil sentetik lame a gen yon sistèm tradiksyon san selil ak yon plasmid ki kode GFP. Sifas lame a dekore ak tags ssDNA. Lipozom parazit la gen plasmid ki kode mCherry, ak yon sistèm tradiksyon men pa gen RNA polymerase (konsa parazit la pa ka eksprime mCherry). Se sifas parazit la dekore ak ssDNA tags konplemantè ak tags yo sou sifas lame a. Tag ADN yo fasilite fizyon lipozom lame a ak parazit ak lame a eksprime tou de pwòp GFP jenomik li yo ak genomic parazit ki gen mCherry. (b-d) Prèv prensip pou genòm lame (GFP) ak parazit (mCherry) konpetisyon pou menm resous selil sentetik yo. Eksperyans sa yo fèt nan solisyon TxTl, pa nan lipozom. De plasmid, ki kode GFP ak mCherry, yo te melanje nan rapò ki endike nan ikon yo plasmid ki sou bò gòch la nan kat chalè a, ak konsantrasyon total ADN echantiyon an endike nan ranje ki anwo kat la chalè. Fluoresans te mezire nan chanèl vèt (GFP) ak wouj (mCherry). Chak plasmid te teste nan de varyant ak pwomotè nan fòs diferan: ak T7 ak ak pwomotè T7Max ki pi fò. Done endividyèl pou tout kat chalè yo bay nan Figi S2−S4. Kou reprezantatif tan endividyèl pou ekspresyon pwoteyin nan lame T7 ak parazit yo bay nan Figi S5-S7 ak pou parazit T7Max nan Figi S8-S10. (e-g) Enfeksyon lame a ak parazit la. Nan chak eksperyans, lipozom lame yo melanje ak lipozom parazit. Fizyon parazit la ak lame a bay ADN mCherry parazit, ki eksprime ansanm ak ADN GFP lame a. Yo te teste diferan rapò lame a ak parazit la, jan sa endike nan ikon ki anba graf ba yo. Genomic lame anba pwomotè T7 a te enfekte ak yon parazit ak genomic li anba panèl pwomotè T7 (e) ak yon parazit ak genomic li anba panèl pwomotè T7Max (f), lame a te fèt tou ak yon genomic T7Max epi li enfekte. ak parazit la ak yon panèl genomic T7 (g). Nan Figi S11 yo bay kou reprezantatif tan endividyèl pou ekspresyon pwoteyin. Eksperyans ki sanble nan pi wo ak pi ba konsantrasyon total lipid yo bay nan Figi S12. Nan Figi S13 yo bay tras pou pirifye eksklizyon gwosè ki montre postfusion estabilite vesik. (h) Enfeksyon ak parazit enkonpatib: parazit la pote pwomotè T7 men ADN ki pa kode. Ba erè yo endike SEM, n=3. Valè fliyoresans nan panno (e-h) yo nòmalize nan fliyoresans ble yon lank manbràn pou nòmalize rezilta yo nan konsantrasyon selil lame yo. Tout seri echantiyon ki make "lame GFP enfekte" se eksperyans, kote lame a ak parazit te gen tags ADN konplemantè sou sifas la, ki pèmèt fizyon lipozom yo, ki rele enfeksyon. Seri ki make "lame GFP an sante" montre echantiyon, kote lame a ak parazit yo te melanje nan rapò yo montre, men pa t 'gen ladan tags fizyon konplemantè, ki fè enfeksyon enposib. Dyaman an nan panno (e-h) endike yon kondisyon enfeksyon patikilye ki pi byen ilistre diferans ki genyen nan lame a ak fòs ekspresyon parazit nan panno (e-g) ak benefis ki genyen nan iminite lame nan panèl (h). Nan Figi S14, yo bay yon konparezon dirèk nan valè lame a ak parazit ki vle di zetwal la. Done pou enfeksyon ak yon parazit san okenn plasmid yo montre nan Figi S15.

Enfeksyon nan yon selil sentetik ka detwi genòm lame a.

Parazit ki dekri pi wo a te eksprime yon mCherry ki kode genomic lè l sèvi avèk resous lame a, men lame a te kenbe kèk nan metabolis li yo epi li te kontinye eksprime GFP malgre enfeksyon an. Apre sa, nou deside mennen ankèt sou yon sistèm kote enfeksyon an rezilta nan yon kontwòl konplè nan metabolis lame a pa parazit la atravè destriksyon nan genòm lame a (Figi 3a). Pou enjenyè yon senaryo konsa, nou te envestige yon dijere anzim restriksyon nan yon plasmid nan TxTl. Nan eksperyans prèv prensip yo, yo te eksprime yon anzim restriksyon MunI nan TxTl san lipozom. Plasmid MunI a te melanje ak plasmid GFP nan diferan rapò. Si plasmid GFP pa gen okenn sit restriksyon MunI, diminisyon relativman ti nan fliyoresans GFP obsève ka konte pou konpetisyon ki te dekri deja ant de plasmid yo pou resous TxTl yo. Si plasmid GFP a gen yon sit restriksyon MunI, fliyoresans GFP diminye anpil, ak diminisyon an pwopòsyonèlman nan yon kantite lajan ogmante nan plasmid MunI-kodaj (Figi 3b). Ekspresyon MunI te kontwole atravè Western Blot ak echèl pwopòsyonèl ak konsantrasyon nan plasmid (Figi 3c).

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Ankouraje pa rezilta sa yo, nou mete kanpe yon eksperyans enfeksyon ak selil sentetik. Lame a te pote plasmid GFP la ak patojèn te pote plasmid MunI la. Konsantrasyon plasmid GFP ak MunI te mete sou 2 mM, byen pi ba pase konsantrasyon saturation plasmid pou TxTl.21 Nou te gen entansyon rete anba konsantrasyon plasmid total kote ekspresyon lame ak parazit ta wo ase pou dirèkteman konpetisyon pou resous limite yo. tankou nan ka a ki dekri pi wo a nan yon parazit senp), olye yo gen entansyon sitou mezire efè a nan anzim nan parazit aktivman detwi genòm nan lame. Tankou nan eksperyans parazit ki dekri pi bonè yo, lame a te genyen bakteri TxTl ak T7 RNA polymerase, patojèn nan te pote sèlman ekstrè selil san T7 RNA polymerase, epi tou de lame a ak patojèn yo te make ak tags fizyon ADN konplemantè. Manbràn lame a te make ak Marina Blue DHPE pou nòmalize rezilta fliyoresans nan konsantrasyon lipozom lame yo. Lame a ak patojèn yo te melanje nan diferan rapò, ak patojèn nan se 25, 50, oswa 75% nan popilasyon total la. Fliyoresans "enfekte" lame a, kote lame a ak patojèn te genyen tags fizyon konplemantè, diminye ak yon ogmantasyon kantite patojèn. Fliyoresans GFP ki soti nan lame a "sante", kote patojèn nan pa t 'gen ladan tags fizyon konplemantè, pa t' diminye nan prezans nenpòt ki kantite patojèn. Echantiyon ki gen sèlman patojèn nan pa te lakòz okenn fliyoresans mezirab (Figi 3d). Ekspresyon patojèn nan pwoteyin MunI te quantifye lè l sèvi avèk analiz Western Blot, ak done yo montre pou seri echantiyon nan lame ki enfekte a (Figi 3e). Apre sa, nou envestige enfeksyon nan ka yon lame iminitè a patojèn nan: plasmid GFP lame a pa t 'gen yon sit restriksyon MunI (Figi 3f). Fliyoresans lame a apre enfeksyon an te diminye, men li pa t osi enpòtan ke nan ka pi bonè yon lame ki gen yon sit MunI nan genomic la. Pwoteyin patojèn MunI te eksprime nan nivo ki konparab ak eksperyans enfeksyon pi bonè (Figi 3g), kidonk chaj metabolik la sou lame a te sanble. Diminisyon fliyoresans lame ki enfekte nan eksperyans sa yo te koze pa kèk nan resous lame yo te detounen pa patojèn ki eksprime MunI, men paske konsantrasyon total plasmid la pi ba anpil pase nan eksperyans yo pi bonè patojèn senp, diminisyon fliyoresans lame a mwens enpòtan. Eksperyans sa a konfime tou ke diminisyon nan fliyoresans nan lame a ak yon sit MunI (Figi 3d) te koze pa kou ekspresyon pwoteyin yo bay nan Figi S22. (g) Ekspresyon MunI te swiv atravè analiz Western blot atravè eksperyans pou echantiyon yo montre nan seri "GFP enfekte" nan panèl (f). Ba erè sou tout panno yo endike SEM, n=3. Valè fliyoresans nan panno (d, f) yo nòmalize nan fliyoresans ble nan lank manbràn yo itilize pou nòmalize rezilta yo nan konsantrasyon selil lame yo. Fluoresans nan panèl (b) nòmalize nan plasmid MunI 0 mM pou chak seri echantiyon. Senbòl dyaman yo nan panno (d, f) mete aksan sou yon kondisyon patikilye ki pi byen ilistre diferans ki genyen nan repons a enfeksyon an soti nan yon lame sansib a panèl patojèn (d) ak iminitè a panèl patojèn (f). Tout seri echantiyon ki make "GFP enfekte" yo se eksperyans, kote lame a ak patojèn te gen tags ADN konplemantè sou sifas la, ki pèmèt fizyon an nan lipozom yo, ki rele enfeksyon. Seri ki make "GFP an sante" montre echantiyon, kote lame a ak patojèn yo te melanje nan rapò yo montre men yo pa t gen tag fizyon konplemantè, sa ki fè enfeksyon enposib.

Figi 3. Enfeksyon detwi genomic lame a epi detounen resous lame yo. (a) Selil lame yo gen plasmid ki kode GFP, ak de sit restriksyon MunI; patojèn nan gen plasmid ki kode anzim restriksyon MunI la. Apre fizyon an nan lame a ak patojèn, TxTl lame a eksprime anzim restriksyon MunI, ki Lè sa a, dijere genomic lame a. (b) Eksperyans prèv prensip pou enfeksyon an: Plasmid GFP te prepare avèk ak san sit restriksyon MunI. Plasmid GFP te melanje ak plasmid MunI epi ekspresyon GFP te anrejistre. Eksperyans sa yo te fèt nan solisyon TxTl san lipozom. Prèv prensip pou eksperyans enfeksyon an, ak anzim MunI ajoute deyò olye pou yo eksprime nan TxTl, yo montre nan Figi S16 ak S17. Yo bay kou reprezantan tan ekspresyon pwoteyin nan Figi S18. (c) Ekspresyon MunI te kontwole pa analiz Western blot; entansite a nan bann MunI te quantifier nan echantiyon yo menm jan ak rezilta fluoresans yo montre nan panèl (b) pou seri "MunI sit absan". Nan Figi S19 yo bay yon blot reprezantan lwès anzim restriksyon MunI. (d) GFP fliyoresans lame a melanje ak lipozom patojèn nan rapò yo montre anba graf done a. Plasmid GFP lame a gen de sit restriksyon MunI. Nan Figi S2 0 yo bay kou reprezantan tan ekspresyon pwoteyin. Done pou eksperyans enfeksyon ak etikèt fizyon enkonpatib yo bay nan Figi S21. (e) Ekspresyon MunI te swiv atravè analiz Western blot atravè eksperyans pou echantiyon yo montre nan seri "GFP enfekte" nan panèl (d). (f) GFP fliyoresans lame a melanje ak lipozom patojèn nan rapò yo montre anba graf done a. GFP lame a pa gen okenn sit restriksyon MunI, ki ba li iminite nan pwoteyin patojèn nan. Yo bay kou reprezantan tan ekspresyon pwoteyin nan Figi S22. (g) Ekspresyon MunI te swiv atravè analiz Western blot atravè eksperyans pou echantiyon yo montre nan seri "GFP enfekte" nan panèl (f). Ba erè sou tout panno yo endike SEM, n=3. Valè fliyoresans nan panno (d, f) yo nòmalize nan fliyoresans ble nan lank manbràn yo itilize pou nòmalize rezilta yo nan konsantrasyon selil lame yo. Fluoresans nan panèl (b) nòmalize nan plasmid MunI 0 mM pou chak seri echantiyon. Senbòl dyaman yo nan panno (d, f) mete aksan sou yon kondisyon patikilye ki pi byen ilistre diferans ki genyen nan repons a enfeksyon an soti nan yon lame sansib a panèl patojèn (d) ak iminitè a panèl patojèn (f). Tout seri echantiyon ki make "GFP enfekte" yo se eksperyans, kote lame a ak patojèn te gen tags ADN konplemantè sou sifas la, ki pèmèt fizyon an nan lipozom yo, ki rele enfeksyon. Seri ki make "GFP an sante" montre echantiyon, kote lame a ak patojèn yo te melanje nan rapò yo montre men yo pa t gen tag fizyon konplemantè, sa ki fè enfeksyon enposib.

Enfeksyon nan yon selil sentetik ka "mòtèl", diminye resous selil lame yo, epi enfeksyon sa yo ka "trete" pou fonksyon sekou.

Eksperyans parazit ak patojèn ki anwo yo te demontre ke selil sentetik yo ka itilize kòm yon modèl pou enfeksyon, kote yon patojèn detounen resous lame a. Apre sa, nou deside mennen ankèt sou yon senaryo kote enfeksyon an lakòz metabolis lame a sispann fonksyone apre ekspresyon pwoteyin patojèn nan. Nan ka sa a, patojèn nan konparab ak enfeksyon ak yon bakteri ki eksprime yon toksin ki ka touye moun mwens aspè replikasyon lame a oswa parazit la paske selil sentetik sa yo pa repwodui (Figi 4a). Enjenyè sistèm sa a, nou te chwazi hemolysin (aHL), yon toksin natirèl ak pwoteyin manbràn lajman ki itilize nan jeni selil sentetik yo kreye porositë manbràn nonspecific.22,23 Nou apresye iwoni nan chwa sa a kòm aHL se natirèlman eksprime pa Staphylococcus aureus kòm yon toksin, epi yo te apwopriye pwoteyin nan pita pou enjenyè transpò manbràn ak pwolonje metabolis selil sentetik.24 Isit la, nou retounen nan itilize aHL pou wòl natirèl li kòm yon toksin danjere ki pwodui pa yon enfeksyon. Yon lòt egzanp remakab nan jeni selil sentetik ki gen rapò ak itilizasyon toksisite aHL pou lakòz lanmò selil natirèl soti nan aplikasyon selil sentetik kòm yon teknoloji terapi kansè.25 Kòm yon prèv prensip, nou te etabli ke eksprime yon gwo konsantrasyon nan aHL nan vesik selil sentetik rezilta nan flit nan kontni selilè ak yon diminisyon enpòtan nan ekspresyon GFP andedan selil la. Efè sa a ka ranvèse si deyò lipozom yo gen tout ti molekil ki nesesè pou TxTl (Figi 4b). Nan sistèm modèl lame-patojèn nou an, lame a gen yon plasmid ki kode GFP ak patojèn nan gen yon plasmid ki kode aHL. Tout konsepsyon eksperyans enfeksyon yo sanble ak senaryo parazit ak patojèn ki dekri pi wo a, ak patojèn nan pa gen okenn RNAP T7 epi tou de lame a ak patojèn dekore ak tag fizyon ADN. Enteresan, nou te obsève ke nan pi ba konsantrasyon patojèn (patojèn nan se 25 oswa 50% nan popilasyon total la), fliyoresans lame a diminye sèlman yon ti kras. Sepandan, ogmante konsantrasyon patojèn nan 75% rezilta nan yon diminisyon enpòtan nan fluoresans GFP lame a (Figi 4c). Nou espekile ke rezilta sa a ta ka koze pa flit relativman dousman nan eleman nitritif ki soti nan selil sentetik nan yon konsantrasyon pi ba aHL. Fluoresans GFP te mezire sèlman apre 12 èdtan nan enkubasyon ak GFP se yon pwoteyin ki trè estab. Se poutèt sa, li posib ke nan ka a nan pi ba konsantrasyon aHL (pi ba kantite lajan patojèn), aHL-koze flit nan eleman nitritif la te ralanti ase ke selil lame yo akimile kantite siyifikatif nan GFP anvan efè yo nan flit la aHL-pwovoke te vin paralize. metabolis la. Pou dekouple rezilta konpetisyon senp pou resous ant jenom lame a ak parazit, nou te fè eksperyans "enfeksyon ak sekou" kote tanpon deyò a te genyen tout ti molekil ki konpoze enèji TxTl, asid amine ak melanj sèl. Sa a te mete kanpe menm jan ak kondisyon "nitritif deyò" yo teste nan Figi 4b. Diminisyon nan fliyoresans lame nan eksperyans sa yo te menm jan ak echantiyon yo anvan "enfeksyon san sekou" ak 25 ak 50% nivo patojèn nan. Diminisyon nan fluoresans lame a nan 75% nan patojèn nan te siyifikativman pi piti pase diminisyon an obsève nan echantiyon san sekou (Figi 4d). Gwo diferans nan rezilta pou eksperyans nan ak 75% nan parazit la, ak pwen done nan figi 4 panno (c, d) make ak yon etwal, sanble sipòte ipotèz nou an ki pi wo konsantrasyon aHL lakòz mal bonè nan reyaksyon an. Nan yon konsantrasyon patojèn ki pi ba, flit la ralanti ase ke GFP lame a akimile (jan yo wè tou de ak ak san eleman nitritif sekou), kidonk fliyoresans GFP obsève a diminye apre enfeksyon sitou akòz konpetisyon an pou resous yo. Nan pi gwo konsantrasyon patojèn, fliyoresans GFP nan echantiyon ak eleman nitritif ekstèn diminye sitou akòz konpetisyon resous yo. Eksperyans sa yo demontre ke nou ka enjenyè selil sentetik pou modèl enfeksyon, sa ki lakòz de rezilta diferan: penalite metabolik nan enfeksyon an tèt li (diminye GFP akòz konpetisyon resous) ak yon enfeksyon ki pi "mòtèl" ki soti nan aboli ekspresyon pwoteyin lame yo. Ankouraje pa obsèvasyon sa a, nou deside mennen ankèt sou yon sistèm nan ki selil sentetik te kapab aktivman reziste kont yon enfeksyon patojèn epi mennen ankèt sou penalite metabolik nan yon repons konsa.

benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè

Selil sentetik yo ka defann kont enfeksyon lè l sèvi avèk yon estrateji ki enspire bakteri.

Enspire pa fonksyon byen li te ye nan endonukleaz restriksyon yo pwoteje bakteri kont ADN etranje, nou t ap chèche anplwaye estrateji sa a nan selil sentetik. Nou te elaji sou sistèm parazit ki prezante nan Figi 2: anplis GFP, nou te ajoute plasmid ki gen MunI nan lame a. Parazit la te genyen mCherry, tankou nan eksperyans anvan yo. Plasmid mCherry a gen yon sit restriksyon MunI (Figi 5a). Premyèman, nou te fè eksperyans prèv prensip pou evalye chaj metabolik eksprime MunI sou lame a. Nan eksperyans TxTl unencapsulated sa yo, nou te kontwole ekspresyon GFP ak ekspresyon mCherry, chak melanje ak yon ogmantasyon kantite plasmid MunI oswa EcorI. Tout jèn yo te anba kontwòl menm pwomotè T7 la. Jèn GFP te gen yon EcorI men se pa yon sit restriksyon MunI ak jèn mCherry te gen yon MunI men se pa yon sit restriksyon EcorI. Lè plasmid anzim restriksyon an te melanje ak yon plasmid pwoteyin fliyoresan san yon sit rekonesans pou anzim restriksyon sa a, ekspresyon pwoteyin fliyoresan an diminye pwopòsyonèlman ak ogmantasyon plasmid anzim restriksyon an, sa ki endike konpetisyon ant de plasmid yo pou resous TxTl, jan yo te demontre pi bonè pou GFP. ak mCherry nan Figi 2. Pè noncutting sa yo te GFP ak MunI (Figi 5b) ak mCherry ak EcorI (Figi 5e). Lè yon pwoteyin fliyoresan te asosye ak yon anzim restriksyon ki kapab koupe jèn nan pou pwoteyin fliyoresan sa a, fliyoresans la diminye anpil nan prèske nivo background nan pi wo konsantrasyon plasmid anzim restriksyon. Pè koupe sa yo te GFP ak EcorI (Figi 5c) ak mCherry ak MunI (Figi 5d). Sa a te endike yon diminisyon nan fluoresans siyifikativman pi lwen pase konpetisyon an senp pou resous ak menm jan ak senaryo a enfeksyon demontre nan Figi 3. Ekspresyon MunI nan prezans GFP diminye ekspresyon GFP. Si nou itilize GFP kòm yon prokurasyon pou metabolis "debaz" lame, Lè sa a, MunI ka wè kòm yon chaj metabolik sou lame a.

Figi 4. Lame a sansib a enfeksyon "mòtèl", men lame a ka sove. (a) Lame a gen plasmid GFP, ak patojèn nan gen plasmid ki kode chanèl manbràn hemolysin (aHL). Apre enfeksyon an, lame a eksprime aHL, ki kreye porositë nan manbràn la, sa ki lakòz flit nan eleman nitritif ak sa ki lakòz yon diminisyon nan aktivite metabolik nan lame a. (b) Prèv prensip pou yon lame ki eksprime aHL (pa gen okenn enfeksyon, lame te kreye ak tou de 5nM GFP ak kantite ki endike nan plasmid aHL). Yo te enkube lame a nan yon tanpon avèk oswa san eleman nitritif (tout konpozan melanj enèji, sèl, ak asid amine yo te itilize pou prepare sistèm tradiksyon selil lame a). Pi gwo konsantrasyon eleman nitritif sekou yo te etabli eksperimantal, done yo montre nan Figi S23. (c) Enfeksyon lame a ak patojèn nan, ak diferan kantite patojèn pou chak selil lame. Flit la nan ti molekil ki soti nan selil "sante" ak "enfekte" yo te dirèkteman mezire lè l sèvi avèk yon ti lank molekil, done yo montre nan Figi S24 ak S25. (d) Eksperyans ki sanble ak sa yo montre nan panèl (c), men tanpon deyò a gen ti eleman nitritif molekil ki sanble ak "éléments deyò" kondisyon eksperimantal yo montre nan panèl (b). Ba erè sou tout panno yo endike SEM, n=3. Valè fliyoresans yo nan panno (b−d) yo nòmalize nan fliyoresans ble nan lank manbràn yo itilize pou nòmalize siyal la nan konsantrasyon selil lame yo. Senbòl dyaman yo nan panno (c, d) mete aksan sou yon kondisyon patikilye ki pi byen ilistre diferans ki genyen nan repons a enfeksyon an soti nan yon lame san panèl eleman nitritif deyò (c) ak iminitè a patojèn nan akòz prezans nan panèl eleman nitritif deyò (d). Pou panno (c, d), seri "GFP enfekte" se lame a kole ak patojèn ki pote pwoteyin aHL, ak "GFP an sante" se lame a kole ak patojèn ki pa pote plasmid.

Nou kontinye nan eksperyans yo enfeksyon, melanje lame a (ak GFP ak MunI plasmid) ak yon parazit (ak plasmid mCherry). Kòm deja, nou te envestige senaryo ak yon kantite parazit ogmante nan popilasyon an (Figi 5f). Kontwòl pozitif nan yon lame ki eksprime mCherry sèlman (ak EcorI olye pou yo MunI balans chaj metabolik la) te kreye yon referans pou kantite maksimòm teyorik pwoteyin patojèn ki ka eksprime nan lame a (Figi 5f). Kòm kantite parazit ogmante, fliyoresans GFP lame a diminye, men diminisyon nan fliyoresans lame enfekte a te siyifikativman pi piti pase diminisyon ekspresyon GFP yo obsève nan eksperyans pi bonè ak menm parazit la. GFP ak parazit mCherry fliyoresans sa a ki enfekte lame ki eksprime MunI (pwen done ki make ak yon etwal nan Figi 5f) ka dirèkteman konpare ak lame enfeksyon ki sanble san MunI (pwen done ki make ak yon etwal nan Figi 2e). Nan lame a eksprime MunI, GFP lame a te kòmanse ak yon nivo absoliman pi ba pandan y ap an sante (paske kèk resous yo detounen nan eksprime MunI) men apre enfeksyon an, diminisyon fliyoresans lame a se anpil mwens enpòtan, ak lame a fè anpil mwens parazit mCherry pwoteyin. pase nan ka lame a pa eksprime MunI. Eksperyans sa a demontre benefis lame a depanse kèk resous pou defans kont parazit. Sistèm sa a ta ka wè kòm yon modèl byochimik trè senp pou òganis ki eksprime pwoteyin pou defann kont enfeksyon nan lavni oswa menm faktè anviwònman danjere. Okòmansman, lame a mwens gaya (si nou pran ekspresyon GFP kòm yon referans pou sante lame), men nan ka ta gen yon enfeksyon, resous adisyonèl lame a te depanse pou eksprime pwoteyin defansiv yo peye, bay pwoteksyon kont parazit la enfekte. Se poutèt sa, nan senp selil sentetik ki pa vivan sa a, nou rekonstitye yon egzanp yon kous zam byolojik fondamantal.

Figi 5. Selil lame yo defann kont enfeksyon. (a) Selil lame yo gen de plasmid: youn kode GFP (san yon sit restriksyon MunI) ak lòt la ki kode anzim restriksyon MunI (jèn "rezistans parazit"). Parazit la gen plasmid mCherry, nan yon sistèm ki sanble ak eksperyans yo montre nan Figi 2. Enfeksyon an medyatè pa fizyon atravè etikèt ADN sou sifas lame a ak parazit. Apre enfeksyon an, plasmid mCherry entwodwi pa parazit la dijere pa anzim restriksyon MunI lame a. (b−e) Mezire pri metabolik pou eksprime rezistans parazit la. Eksperyans yo nan yon sistèm TxTl esansyèl, pa ankapsule nan vesik. Nan chak eksperyans, plasmid pwoteyin fliyoresan (GFP oswa mCherry) te melanje ak plasmid anzim restriksyon (MunI oswa EcorI) nan rapò ki endike sou aks x la pou konsantrasyon total plasmid 10 mM. GFP gen yon sit restriksyon EcorI men se pa yon sit MunI, epi mCherry gen yon sit restriksyon MunI men pa yon sit restriksyon EcorI. Trendline a se yon gid vizyèl men se pa yon anfòm done. Ba erè yo endike SEM, n=3. Eksperyans kontwòl ak anzim restriksyon pirifye, olye pou yo eksprime yo nan yon plasmid, yo bay nan Figi S26. Yo te mezire estabilite lipozom ak yon kantite plasmid parazit ogmante, done yo montre nan Figi S27. (f) Enfeksyon nan lame a ak yon ogmantasyon kantite parazit. "Host GFP an sante" se ekspresyon GFP ki soti nan selil lame ki te kole ak parazit la san okenn plasmid. "Host GFP enfekte" se lame a kole ak parazit ki pote mCherry. Fliyoresans wouj la se fliyoresans mCherry ki soti nan parazit la kole ak lame a (sèlman done ki soti nan lame ki enfekte a ki disponib. Echantiyon lame an sante yo pa t pote plasmid mCherry). Ba erè sou tout panno yo endike SEM, n=3. Valè fliyoresan yo nòmalize nan fliyoresans ble nan lank manbràn yo itilize pou nòmalize rezilta yo nan konsantrasyon selil lame yo. Senbòl dyaman an endike ekspresyon pwoteyin parazit la nan kondisyon enfeksyon patikilye, dirèkteman konparab ak pwen done make ak yon etwal nan Figi 2e yon eksperyans nan menm kondisyon yo, men ak lame a manke jèn rezistans MunI.

Figi 6. Inokulasyon bay defans kont enfeksyon. (a) Lame a gen plasmid GFP. Patojèn nan eksperyans sa yo se youn nan twa konplo enfeksyon yo demontre nan papye sa a: yon parazit (jan yo montre nan Figi 2), yon patojèn ak anzim restriksyon MunI ki dijere genòm GFP lame a (jan yo montre nan Figi 3), oswa yon patojèn. pote kanal la manbràn aHL sa ki lakòz flit nan eleman nitritif soti nan lame a (jan yo montre nan Figi 4). Nan chak ka, lame a ak patojèn gen tags fizyon ADN konplemantè. Anvan entwodwi patojèn nan, lame a "inokulasyon": enkubasyon ak eksè oligos ssDNA konplemantè ak tags ADN fizyon yo sou sifas lame a (tag ki idantik ak sa yo sou patojèn nan mwens kantite kolestewòl yo itilize pou jete tag nan manbràn nan). patojèn nan). Inokulasyon an lakòz tag fizyon yo sou sifas lame a vin doub-bloke, kidonk fè fizyon an ak patojèn nan enposib. (b) Prèv prensip pou konplo vaksinasyon an. Popilasyon lipozòm ki pote GFP anba kontwòl pwomotè T7 RNA a, men san T7 RNA polymerase, fusion ak liposomes ki gen T7 RNA polymerase. Pwoteyin GFP ka eksprime sèlman si de popilasyon yo fusion. Youn oswa toude nan patnè yo melanje yo te "inokulasyon" pa enkubasyon ak yon tag ADN konpatib ak tag yo fizyon sou sifas la nan lipozom nan, rann tag yo fizyon doub-bloke e konsa enkonpatib ak fizyon. Yon kou reprezantatif tan pou ekspresyon pwoteyin yo montre nan Figi S28. Eksperyans kontwòl san okenn tag fizyon yo nan Figi S29, ak kontwòl ki gen tag fizyon enkonpatib yo bay nan Figi S30. Konsantrasyon oligo inokulasyon an te etabli eksperimantal, done yo montre nan Figi S31. (c) Eksperyans enfeksyon parazit. Yon lame pote GFP te kole ak yon parazit pote mCherry, jan sa dekri nan Figi 2. Lame a ak parazit yo te melanje ak yon rapò varye nan lame a parazit la; selil lame yo te swa inokule (avèk etikèt fizyon ADN doub-chèn pa konpatib ak fizyon) oswa yo pa inokule (kidonk sansib a fizyon ak parazit la). Yo rapòte fliyoresans mCherry sèlman pou echantiyon ak lame a pa te vaksinen paske pa te gen okenn fliyoresans mCherry ki ka mezire nan echantiyon lame yo vaksine. Yo te teste yon inokulasyon ranvèse pa inokulasyon parazit la olye pou yo lame a, done yo montre nan Figi S32. (d) Eksperyans enfeksyon ak genomik lame a sansib a patojèn ki pote anzim restriksyon MunI, jan sa dekri nan Figi 3. Seri done ki enfekte a reprezante yon lame san inokulasyon, ak seri done inokulasyon an reprezante echantiyon ak lame a enkube ak oligos inokulasyon, kidonk pa sansib a fizyon ak patojèn nan. (e) Eksperyans enfeksyon ak patojèn ki pote jèn aHL, rezilta nan chanèl aHL koule eleman nitritif soti nan selil lame yo apre enfeksyon, jan sa dekri nan Figi 4. Seri done ki enfekte reprezante lame a san yo pa inokulasyon ak seri done inokulasyon reprezante echantiyon ak lame enkube ak inokulasyon oligos, kidonk pa sansib a fizyon ak patojèn nan. Ba erè sou tout panno yo endike SEM, n=3. Valè fliyoresans nan panno (c−e) yo nòmalize nan fliyoresans ble nan lank manbràn yo itilize pou nòmalize rezilta yo nan konsantrasyon selil lame yo. Gen kèk done yo montre nan figi sa a se eksperyans ak konfigirasyon ki idantik ak eksperyans yo montre nan figi anvan yo (jan sa endike nan chak tit). Eksperyans sa yo te repete pou figi sa a pwodwi done lè l sèvi avèk menm pakèt TxTl pou konpare dirèkteman rezilta yo, elimine varyasyon pakèt preparasyon TxTl.

Inokulasyon nan selil sentetik anpeche enfeksyon.

Nan egzanp ki dekri pi wo a, nou demontre lame a defann kont enfliyans nan genomic yon patojèn nan eksprime yon pwoteyin siplemantè. Apre sa, nou te mande si li posib pou modèl yon senaryo, kote kèk entèvansyon fè yon lame ki te deja sansib a iminitè kont enfeksyon an plas an premye. Nou te rele li yon modèl inokulasyon. Pandan ke rekonèt sa a se byen lwen soti nan yon analoji pafè, aspè nou konsantre sou se ke selil sentetik lame a pa depanse okenn resous sou jenere iminite. Nan modèl vaksinasyon nou an, nou te kreye yon tretman ki fè selil sentetik lame ki sansib a enfeksyon an nan selil ki pa ka fusion ak yon patojèn. Sistèm fizyon selil sentetik yo itilize nan tout papye sa a depann sou etikèt ADN yon sèl-bloke pou pwovoke fizyon manbràn lipozom. Pou inokule kont fizyon ak yon patojèn, nou enkube selil yo ak oligonukleotid ADN konplemantè ak oligo fizyon an sou sifas selil yo (Figi 6a). Premyèman, nou te bezwen konfime ke inokulasyon pa enkubasyon ak oligo konplemantè travay pou aboli fizyon. Nan eksperyans prèv prensip yo, de popilasyon lipozom yo te prepare: yon popilasyon te gen TxTl ak yon plasmid ki kode GFP anba kontwòl pwomotè T7 la ak lòt popilasyon an te gen TxTl ak T7 RNA polymerase men pa gen plasmid. Apre fizyon de popilasyon sa yo, plasmid GFP melanje ak T7 RNA polymerase ak pwovoke ekspresyon GFP. Si de popilasyon yo te gen tag fizyon sèl-bloke ak konplemantè, fizyon te fèt epi yo te detekte fluoresans GFP. Si youn oswa toude popilasyon yo te enkube ak yon oligonukleotid konplemantè ak tag fizyon an, fizyon an lipozom pa t 'rive ak GFP pa te eksprime (Figi 6b). Lè nou te etabli sistèm inokulasyon an, nou te kòmanse prezante vaksinasyon pou pwoteje selil sentetik lame yo nan twa nan senaryo enfeksyon ki dekri pi bonè nan travay sa a. Premyèman, nou te itilize senaryo parazit ki dekri nan Figi 2. Selil lame yo, ki gen yon jenom GFP, yo te inokule ak yon oligo konplemantè ak tag fizyon an sou sifas lame a, epi yo te lame a melanje ak parazit mCherry. Nou melanje lame a ak parazit la nan diferan rapò. Anba tout kondisyon enfeksyon, fliyoresans mCherry parazit la pa detektab si lame a te vaksinen epi fliyoresans GFP nan lame inokulasyon an pa t diminye. Eksperyans kontwòl yo ak lame ki pa inokulasyon an te montre yon diminisyon nan ekspresyon GFP lame a ak yon ogmantasyon nan siyal mCherry parazit la, jan yo espere (Figi 6c). Apre sa, nou aplike sistèm inokulasyon an nan ka yon lame ki enfekte ak yon patojèn ki pote yon anzim restriksyon MunI ki kode genòm ki kapab dijere genòm GFP lame yo, tankou nan eksperyans yo montre nan Figi 3. Lame inokulasyon an pa t montre yon diminisyon. nan GFP fluoresans apre melanje ak ogmante kantite patojèn nan, pandan y ap lame a noninoculated te enfekte ak fliyoresans GFP lame a diminye pwopòsyonèlman nan kantite lajan an ogmante nan patojèn (Figi 6d). Vaksinasyon an te efikas tou kont patojèn aHL. Lame yo inokulasyon pa te montre okenn diminisyon nan fliyoresans lè yo melanje ak patojèn nan, pandan y ap fluoresans GFP lame ki pa inokulasyon an diminye anpil ak enfeksyon (Figi 6e). Nan tout ka, pwosedi inokulasyon senp sa a, enkubasyon lame a ak yon oligo ADN konplemantè ak oligo fizyon sou sifas lame a, te ase pou aboli kapasite selil patojèn sentetik yo enfekte selil lame yo. Se poutèt sa, nou demontre yon senp modèl fizikochimik nan entèvansyon ki pwoteje selil lame kont enfeksyon.

benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè

KONKLIZYON

Nan papye sa a, nou demontre metòd pou itilize selil minim sentetik pou modèl enfeksyon parazit ak patojèn. Motivasyon dèyè travay nou an te de fwa. Nou te vle enjenyè konplèks, konpòtman ki sanble ak lavi nan selil sentetik, fasilite objektif la nan jeni selil sentetik ki pi sanble ak selil natirèl vivan. Nou te vle tou pran avantaj de sistèm selil sentetik senp ak kontwole pou modèl pwopriyete debaz enfeksyon, inokulasyon, ak pwosesis rezistans. Pandan ke selil sentetik pa evolye oswa pwòp tèt ou-repwodui, sistèm sa a pèmèt pou etidye dinamik enfeksyon nan yon modèl ki senp epi fasil pou analize. Nou espere ke prensip enfeksyon ki dekri la a pral ede kreye modèl pratik ak aplikab pou diferan patojèn ak alèjman enfeksyon. Etidye sistèm selil sentetik senplifye sa a te mete aksan sou entèraksyon fondamantal ant parazit la ak patojèn nan. Pandan ke selil sentetik yo pa (ankò) vivan, epi yo pa gen kapasite nan sibi evolisyon Darwinian, sistèm sa a pèmèt nou obsève entèraksyon patojèn ak lame san kapasite nan devlope iminite natirèl oswa chanje virulans patojèn nan. Pandan ke dinamik enfeksyon lame yo prezante isit la itilize selil sentetik ki baze sou bakteri, sistèm sa a pa natirèlman limite a bakteri TxTl. Li ta menm posib imajine lè l sèvi avèk sistèm ki prezante isit la pou modèl dinamik enfeksyon nan popilasyon ki sanble ak ekosistèm natirèl, pran avantaj de senplisite nannan nan selil sentetik yo konplètman kontwole ak etidye entèraksyon ki genyen ant diferan manm nan popilasyon gwo.

REFERANS

(1) Aplikasyon. Mater. Jodi a 2016, 19, 516−532.

(2) Gaut, NJ; Adamala, KP rekonstitye eleman selil natirèl nan selil sentetik. Adv. Biol. 2021, 5, nimewo 2000188.

(3) Tan, C.; Saurabh, S.; Bruchez, Deputy; Schwartz, R.; Leduc, P. Molecular Crowding Shapes Gene Expression nan nanosystèm selilè sentetik. Nat. Nanotechnol. 2013, 8, 602−608.

(4) Glantz, ST; Berlew, EE; Chow, BY entèfas manbràn sentetik selil ki tankou pou sonde entèraksyon dinamik pwoteyin-lipid, 1ye ed.; Elsevier Inc, 2019; Vol. 622.

(5) Zhao, J.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Li, C.; Du, H.; Sønderskov, SM; Mu, W.; Dong, M.; Han, X. Mimicking Cellular Metabolism nan selil atifisyèl: Transpò molekil inivèsèl atravè manbràn nan atravè fizyon Vesicle. Anal. Chem. 2022, 94, 3811−3818.

(6) Damiano, L.; Stano, P. Sou "Life-Likeness" nan selil sentetik. Devan. Bioeng. Biotechnol. 2020, 8, Nimewo 953.

(7) Salehi-Reyhani, A.; Ces, O.; Elani, Y. Imite selil atifisyèl kòm modèl senplifye pou etid byoloji selilè. Eksp. Biol. Med. 2017, 242, 1309−1317.

(8) Chakraborty, T.; Wegner, SV Siyal selil a selil atravè limyè nan kominote selil atifisyèl yo: Predatè lumineux fè lasisiy bèt yo. ACS Nano 2021, 15, 9434−9444.

(9) Dupin, A.; Simmel, FC Signaling and Differentiation in Emulsion-Based Multi-Compartmentalized in Vitro Gene Circuits. Nat. Chem. 2019, 11, 32−39.

(10) Toparlak, OD; Zasso, J.; Bridi, S.; Serra, MD; Macchi, P.; Kont, L.; Baudet, M.-L.; Mansy, SS Selil atifisyèl kondwi diferansyasyon neral. Sci. Adv. 2020, 6, Nimewo eabb4920.

(11) Robinson, AO; Venero, OM; Adamala, KP nan direksyon pou lavi sentetik: Biomimetic sentetik selil kominikasyon. Curr. Opinyon. Chem. Biol. 2021, 64, 165−173.

(12) Smith, JM; Chowdhry, R.; Booth, MJ Kontwole Kominikasyon Selil Selil Selil. Devan. Mol. Biosci. 2022, 8, Nimewo 1321.

(13) Elani, Y. Entèfas k ap viv ak selil sentetik kòm yon fwontyè emerge nan byoloji sentetik. Angew. Chem., Ent. Ed. 2021, 60, 5602− 5611.

(14) Rustad, M.; Eastlund, A.; Jardine, P.; Noireaux, V. Selil-gratis TXTL Sentèz Bakteriophage enfektye T4 nan yon reyaksyon sèl tib tès. Sentèz. Biol. 2018, 3, No ysy002.

(15) Marshall, R.; Noireaux, V. Modèl Kantitatif nan Transkripsyon ak Tradiksyon nan yon All-E. coli Sistèm san selil. Sci. Rep. 2019, 9, Nimewo 11980.

(16) Garamella, J.; Marshall, R.; Rustad, M.; Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: Yon Platfòm pou Biyoloji Selil Santetik. ACS Synth. Biol. 2016, 5, 344−355.

(17) Deich, C.; Lajan Kach, B.; Sato, W.; Sharon, J.; Aufdembrink, L.; Gaut, NJ; Heili, J.; Stokes, K.; Engelhart, AE; Adamala, KP T7Max Transcription System. 2021, 1−28.

(18) Gaut, NJ; Gomez-Garcia, J.; Heili, JM; Lajan Kach, B.; Han, Q.; Engelhart, AE; Adamala, KP pwogramasyon fizyon ak diferansyasyon nan Selil Minimal sentetik. ACS Synth. Biol. 2022, 11, 855− 866.

(19) Stengel, G.; Zahn, R.; Höök, F. ADN-induit fizyon pwogramasyon nan vesik fosfolipid. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 9584− 9585.

(20) Chizzolini, F.; Forlin, M.; Yeh Martín, N.; Berloffa, G.; Cecchi, D.; Mansy, SS Tradiksyon San Selil Plis Varyab pase Transkripsyon. ACS Synth. Biol. 2017, 6, 638−647.

(21) Shin, J.; Noireaux, V. Yon bwat zouti ekspresyon san selil E. coli: Aplikasyon nan sikui jenetik sentetik ak selil atifisyèl. ACS Synth. Biol. 2012, 1, 29−41.

(22) Noireaux, V.; Libchaber, A. Yon Bioreactor Vesicle kòm yon etap nan direksyon yon Asanble selil atifisyèl. Pwosedi. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 17669−17674.

(23) Adamala, KP; Martin-Alarcon, DA; Guthrie-Honea, KR; Boyden, ES Jeni Jenetik Awondisman Entèraksyon nan ak ant Selil Minimal Sentetik. Nat. Chem. 2017, 9, 431−439.

(24) Noireaux, V.; Bar-Ziv, R.; Godefroy, J.; Salman, H.; Libchaber, A. Nan direksyon pou yon selil atifisyèl ki baze sou ekspresyon jèn nan vesik. Phys. Biol. 2005, 2, P1−P8.

(25) Krinsky, N.; Kaduri, M.; Zinger, A.; Shainsky-Roitman, J.; Goldfeder, M.; Benhar, mwen; Hershkovitz, D.; Schroeder, A. Selil sentetik yo fè sentèz pwoteyin ki ka geri andedan timè yo. Adv. Swen Sante Mater. 2018, 7, Nimewo 1701163.

(26) Kwon, YC; Jewett, MC Metòd preparasyon wo-debi nan ekstrè brit pou sentèz pwoteyin solid san selil. Sci. Rep. 2015, 5, No 8663.

(27) Solèy, ZZ; Hayes, CA; Shin, J.; Caschera, F.; Murray, RM; Noireaux, V. Pwotokòl pou mete ann aplikasyon yon sistèm ekspresyon TXTL ki baze sou Escherichia Coli pou byoloji sentetik. J. Vis. Eksp. 2013, 79, 1−15.

(28) Fujii, S.; Matsuura, T.; Sunami, T.; Nishikawa, T.; Kazuta, Y.; Yomo, T. Liposome Display pou seleksyon in vitro ak evolisyon pwoteyin manbràn. Nat. Pwotok. 2014, 9, 1578−1591.

(29) Löffler, PMG; Ries, O.; Rabe, A.; Okholm, AH; Thomsen, RP; Kjems, J.; Vogel, S. Yon kaskad fizyon lipozom ki pwograme ADN. Angew. Chem., Ent. Ed. 2017, 56, 13228−13231.