Pati 1 Diskriminasyon chimik ak jenetik nan Cistanches Herba ki baze sou UPLC-QTOF/MS ak kòd bar ADN
Mar 03, 2022
Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com
Résumé
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), ke yo rekonèt kòm '' Ginseng nan dezè a'', gen yon efè guérison frape sou fòs ak nouriti, espesyalman nan ranfòsman ren ranfòse Yang. Sepandan, de orijin plant Cistanches Herba, Cistanche deserticola ak Cistanche tubulosa, varye an tèm de aksyon famasi ak eleman chimik yo. Pou diskrimine orijin plant Cistanches Herba, yon sistèm metòd konbine chimik ak jenetik -UPLC-QTOF/MS teknoloji ak DNA barcoding - te premye anplwaye nan etid sa a. Rezilta yo te endike ke twa konpoze makè potansyèl (yon izomè nan campneoside II, cistanoside C, ak cistanoside A) yo te jwenn pou fè diskriminasyon de orijin yo pa analiz PCA ak OPLS-DA. ADN barcoding pèmèt yo diferansye de orijin avèk presizyon. NJ pye bwa te montre ke de orijin gwoupe nan de klad. Konklizyon nou yo demontre ke de orijin Cistanches Herba genyen diferan konpozisyon chimik ak varyasyon jenetik. Sa a se premye evalyasyon rapòte de orijin Cistanches Herba, ak konklizyon an pral fasilite kontwòl kalite ak aplikasyon klinik li yo.
Entwodiksyon
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), ke yo rekonèt kòm ''Ginseng nan dezè a'', soti nan tij sukulan sèk nanCistanche deserticolaYC Ma akCistanche tubulosa(Schrenk) perik dapre Chinwa Pharmacopeia (2010 edisyon), epi li se popilè pou tonifyan li yo nan ren-yin, benefisye esans lavi ak entesten ap detann. Kounye a,Cistanches Herbase sitou distribye nan dezè arid ak cho nan nòdwès Lachin, patikilyèman nan pwovens Xinjiang ak Inner Mongoli. Sepandan, de orijin yo nanCistanches Herbadiferan an tèm de aktivite famasi yo ak eleman chimik yo. Tu et al. te envestige dekoksyon twa espès Cistanche (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa) e li te jwenn saC. tubulosate montre efè ki pi ba nan modèl sourit Yang-deficiency [1]. Zhang et al. konpare aktivite famasi antC. deserticola, C. tubulosa,epiC. salsa,epi li te jwenn ke espès sa yo te gen fonksyon medsin tankou anti-fatig ak tolerans ipoksi, men se pa nan menm limit [2]. Rechèch anvan yo rapòte eleman chimik la epi li endike diferans nan eleman chimik ak kontni pou orijin plant nanCistanches Herba[3]. Kòm pou aplikasyon nan klinik ak sikilasyon mache, kòm yon òtifyan,C. tubulosate tradisyonèlman itilize kòm yon ajan sikilasyon san-pwomosyon ak nan tretman an nan fèblès, esterilite, lonbago, feblès kò nan Japon [4-8]. Kontinwe, li se nan gwo siyifikasyon diskriminasyon de orijin nanCistanches Herbapou kontwòl kalite ak aplikasyon klinik. Sepandan, pa gen okenn konsantre rechèch sou diskriminasyon de orijin nanCistanches Herba. Anpil metòd rechèch, ki gen ladan mikwoskospi, iltravyolèt, ak deteksyon enfrawouj, metòd repetisyon entè-senp sekans yo te itilize pou idantifye genus nan.Cistanches, men se pa sèlman pou de orijin espesyalman [9–20]. Isit la, nou itilize teknik chimik ak molekilè ansanm pou fè distenksyon ant de orijin Cistanches Herba, UPLC QTOF/MS (kwomatografi likid ultra-pèfòmans makonnen ak espektometri mas tan-de-vol quadrupole) ak kòd ADN. UPLC-QTOF/MS bay enfòmasyon pi rapid ak efikasite konpare ak lòt teknik. Gwo selektivite ak sansiblite UPLC-QTOF/MS te lakòz aplikasyon li pou analiz quantitative ak kalitatif, osi byen ke nan analiz metabolit ak idantifikasyon konpoze konplèks nan Medsin Tradisyonèl Chinwa [21-22]. Analiz prensipal eleman (PCA) ak pwojeksyon ortogonal nan analiz diskriminan estrikti inaktif (OPLSDA) yo devlope tou pou idantifye konpoze makè potansyèl yo. ADN barcoding, yon teknoloji makè molekilè ki pi fasil ak pi inivèsèl, sèvi ak yon fragman ADN pou idantifye espès oswa jenera. Li se objektif, pi egzak, ak pi fasil pou fè pase metòd idantifikasyon tradisyonèl yo ak lòt teknoloji makè molekilè. Anplis, kòd ADN yo te aplike avèk siksè pou idantifye bèt ak plant, ki gen ladan plant medsin [23-26]. Objektif rechèch sa a se etabli yon sistèm metòd syantifik, konbine UPLC-QTOF/MS ak kòd ADN, pou diskriminasyon de orijin plant nan.Cistanches Herba.
Cistanches tout rasin
Materyèl ak Metòd
Deklarasyon etik Nou konfime ke etid sou teren yo pa t enplike espès ki an danje oswa ki pwoteje. Kowòdone GPS yo te enkli nan echantiyon enfòmasyon an, tanpri gade tablo 1."
Materyèl plant ak reyaktif
Tij sukulan nan Cistanches Herba yo te kolekte nan rejyon yo dezè sovaj nan Inner Mongolia, pwovens Qinghai, Xinjiang Uygur Rejyon Otonòm, Repiblik Pèp la nan Lachin (Tablo 1) nan mwa me 2012. Echantiyon yo nan rechèch la tout te kolekte nan rejyon dezè sovaj, pa nan tè prive, kote pa gen okenn otorizasyon espesifik yo te mande. Dr Linfang Huang te konfime idantite botanik tij yo. Yo te depoze echantiyon bon nan Enstiti pou Devlopman Plant Medsin. High-pèfòmans likid chromatography (HPLC)-klas asetonitrile (Merck KGaA, Darmstadt, Almay) ak asid fòmik (Tedia, USA) yo te itilize pou analiz UPLC. Dlo deyonize yo te pirifye lè l sèvi avèk yon sistèm Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Tout lòt pwodwi chimik yo te nan klas analyse.
Preparasyon echantiyon
Yo te transfere echantiyon Cistanches Herba (1.0 g, 65-may) nan yon flacon konik 50-mL, epi yo te ajoute 50 mL 70 pousan metanol. Apre tranpe pou 30 min, ultrasonication (35 kHz) te fèt nan tanperati chanm pou 30 min. Apre santrifujasyon nan 10,000 rev/min pou 10 min, supernatant la te estoke nan 4uC epi filtre nan yon manbràn 0.22-mm anvan piki nan sistèm UPLC-QTOF/MS pou analiz.
UPLC-QTOF/MS
Pou analiz UPLC, yo te itilize sistèm/paramèt sa yo: Waters Acquity system (Waters) ekipe ak yon ponp livrezon sòlvan binè, echantiyon oto ak detektè PDA ki konekte ak yon estasyon done Waters Empower 2; ultrasonication (250 W, 50 kHz, Kunshan ultrasonic enstriman co, Zhejiang, Lachin); ak yon modèl balans elektwonik analyse AB135-2 (Mettler Toledo., Greifensee, Zurich, Swis). Yon kolòn Waters Acquity UPLC BEH C18 (1.7 mm, 2.16100 mm, Waters) ak yon kolòn gad Waters C18 (menm materyèl, dlo) yo te itilize epi konsève nan 30uC. Faz mobil lan te 0.1 pousan asid fòmik solisyon akeuz (A) ak asetonitrile (B) ak yon pwogram gradyan jan sa a: 0-3 min, 10-22 pousan B; 3–4 min, 22–23 pousan B; 4–6 min, 23–35 pousan B; 6–8 min, 35–37 pousan B; 8–11 min, 37–42 pousan B; 11– 12 min, 42–48 pousan B; 12–15 min, 48 pousan –50 pousan B nan yon vitès koule 0.3 mL/min. Volim piki a te 5 ml.
Analiz UPLC/MS te fèt sou yon sistèm QTOF Synapt G2 HDMS (Waters, Manchester, UK) ekipe ak yon sous electrospray ionizasyon (ESI) ki opere nan mòd negatif-ion. N2 te itilize kòm gaz desolvasyon. Tanperati desolvasyon an te fikse nan 45{{10}}uC nan yon vitès koule 800 L/h, ak tanperati sous la te fikse nan 120uC. Voltaj kapilè ak kòn yo te fikse a 2500 ak 40 V, respektivman. Done yo te kolekte ant 50-1200 Da ak yon tan eskanè 0.1-s ak yon reta 0.01-s interscan sou yon tan analiz 15-min. Agon te itilize kòm gaz la kolizyon nan yon presyon nan 7.06661023 Pa. Tout done MS yo te kolekte lè l sèvi avèk sistèm nan LockSpray asire presizyon mas ak repwodibilite. [MH]-ion nan leucine-enkephalin nan m/z 554.2615 te itilize kòm mas la fèmen nan mòd negatif ESI.
Analiz done
Done UPLC-QTOF/MS pou echantiyon Cistanches Herba yo te analize pou idantifye varyab potansyèl diskriminatwa. Jwenn pik, aliyman ak filtraj nan done anvan tout koreksyon ES yo te fèt lè l sèvi avèk manadjè aplikasyon Marker Lynx, vèsyon 4.1 (Waters, Man chester, UK). Paramèt yo te itilize yo te jan sa a: tan retansyon (tR) 0–15 min, mas 50–1200 Da, tolerans tan retansyon 0.02 min, ak tolerans mas. nan 0.02 Da. Yo te itilize twa echantiyon replike yo kolekte nan chak kote jewografik (n=3). Yo te itilize yon total de 6, 339 varyab pou kreye modèl la.
ADN barcoding: ekstraksyon ADN, anplifikasyon PCR ak sekans
Echantiyon yo te pran nan tij chèch chèch nan C. deserticola ak C. tubulosa (30 mg) yo te fwote pou 2 minit nan yon frekans nan 30 r / s. ADN te ekstrè selon enstriksyon manifakti a (Tiangen). Espesyalman, yo te modifye pwotokòl la pou yo te ranplase klowofòn ak yon melanj de klowofòm: alkòl izoamil (24:1 nan menm volim), ak solisyon tanpon GP2 ak izopropanol (menm volim). Yo te mete poud nan fwote nan 1.5 ml tib eppendorf, ajoute 700 mL 65uC prechofe GP1 ak 1 mL b-mercaptoethanol melanje lè l sèvi avèk vortex pou 10-20 s, ak enkubasyon pou 60 minit nan 65uC; Ajoute 700 mL melanj de klowofòm: alkòl izoamil (24:1), santrifuje pou 5 minit nan 12000 rpm (,134006g); Pipèt supernatant nan yon nouvo tib, ajoute 700 mL izopropanol, melanje pou 15-20 minit; Mete tout melanj lan nan kolòn vire CB3 epi santrifije pou 40 s nan 12000 rpm; Jete filtraj la epi ajoute 500 mL GD (ajoute quantitative etanòl anidrid anvan ou itilize), santrifuje nan 12000 rpm pou 40 s; jete filtraj la epi ajoute 700 mL PW (ajoute quantitative etanòl anidrid anvan ou itilize) pou lave manbràn an, santrifije pou 40 s nan 12000 rpm; Jete filtraj la epi ajoute 500 mL PW, santrifije pou 40 s nan 12000 rpm; Jete filtraj la ak santrifize pou 2 minit nan 12000 rpm pou retire tanpon lave rezidyèl PW; Transfere kolòn vire CB3 a nan yon tib eppendorf pwòp 1.5 ml, epi siye nan tanperati chanm pou 3-5 minit; Santrifije pou 2 minit nan 12000 rpm pou jwenn ADN total la. Jadendanfan pou reyaksyon chèn polymerase (PCR) yo te baze sou sekans yo te rapòte deja [4,5]. Melanj reyaksyon PCR yo te genyen 2-mL ADN modèl, 8.5- mL ddH2O, 12.{5-mL 26Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Lachin), 1/{{57 }}mL anvan/anvèse (F/R) primè (2.5 mM), nan yon volim final 25 mL. Anplifikasyon PCR te fèt jan Kress et al. [4]. Jadendanfan reyaksyon PCR yo te fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) ak rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39). Pwodwi PCR yo te separe ak detekte pa elektwoforèz jèl agarose 1 pousan. Pwodwi PCR yo te pirifye swiv pwotokòl manifakti a ak dirèkteman sibi sekans.
Konpoze prensipal la efikas nan cistanche: Acteoside
Rezilta yo
UPLC-QTOF/MS plasman pik pwovizwa Kwomatogram reprezantan C. deserticola ak C. tubulosa ki soti nan diferan zòn pwodui yo montre nan Figi 1. Kwomatogram anprent yo endike resanblans pami echantiyon Cistanches Herba. Yon total de 23 pik mas kalifye yo te detekte ak 16 pik yo te idantifye lè yo matche tan yo retansyon ak spectre mas yo ak sa yo te rapòte anvan (Tablo 2) [29-35]. Pik 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22, ak 23 yo te idantifye kòm cistanoside F, mussaenoside asid, cistanbuloside C1/C2, kanneoside II. , izomè nan kanneozid II, echinacoside, cistanoside A, acteoside, izoakteozid, siringalid A-39-aL-ramnopyranoside, cistanoside C, 29-acetylacteosid, osmanthuside B, cistanoside D, tubuloside B, ak cistancinenside A, respektivman . Konstitiyan chimik yo te detèmine yo dwe prensipalman glikozid phenylethanoid (PhGs), pandan y ap yon sèl konpoze, asid mussaenoside, se te yon polisakarid iridoid. PhG yo se konpoze prensipal yo aktif an tèm de tretman defisyans ren, ak efè antioksidan ak neropwotektif [36]
PCA nan C. deserticola ak C. tubulosa
PCA te anplwaye pou fè distenksyon ant echantiyon diferan espès plant yo. PCA se yon metòd analiz done miltivarye san sipèvizyon ki vize pou wè resanblans ak / oswa diferans ki genyen nan done miltivarye nan konpozisyon metabolit segondè [37]. Modèl PCA de-konpozan an kimilatif te reprezante 46.04 pousan nan varyasyon an (PC1, 36.43 pousan; PC2, 9.61 pousan). Figi 2 montre ke 24 echantiyon yo te gwoupe nan de gwoup nan nòt PCA yo trase dapre orijin espès, ki endike ke konpozisyon chimik nan C. deserticola ak C. tubulosa diferan anpil.
Konpoze prensipal la efikas nan cistanche: Echinacoside
