Pati 2: Echinacoside ogmante kantite espèm nan rat pa vize reseptè androjèn ipotalamik la

Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

Pls klike isit la pou pati 1

Eksperyans tretman.

Eksperyans 1. Sourit yo te owaza divize an sis gwoup, sèt sourit nan chak gwoup (n=7).ECH(Echinacoside soti nan cistanche)(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, Lachin) yo te administre lè l sèvi avèk yon tib entragastric, epi yo te bay testostewòn propionate (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, Lachin) pa piki miskilè yon fwa chak jou pou 14 jou dapre konsepsyon eksperimantal sa a: Gwoup kontwòl: saline nòmal (10 mL/kg), ECH_(L)gwoup (5 mg/kg), ECH_(M)gwoup (20 mg/kg), ECH_(H)gwoup (80 mg/kg), TP (15 mg/kg) ak enzalutamide (inibitè AR, yon fwa chak jou chak jou pou 14 jou; 20 mg/kg; CAS: 915087- 33-1; Aladin, Shanghai, Lachin).

Apre 2 semèn tretman, sourit yo te anestezi ak etè dyetil pou kolekte echantiyon san pou analiz nivo òmòn yo. Lè sa a, sourit yo te diseke pou separe ipotalamus la, ansefal plis pitwitèr, tèstikul ak epididim cauda. Yo te mete echantiyon cauda epididymis nan saline nòmal ak 5 pousan BSA pou evalyasyon kalite espèm, epi ipotalamus la, ansefal plis pitwitè ak tèstikul yo te jele nan nitwojèn likid epi estoke nan -80 degre pou plis envestigasyon.

Eksperyans 2. Sourit yo te owaza divize an 10 gwoup, senk bèt pou chak gwoup. Yo te administre ECH (20 mg/kg) oralman epi yo te anestezi sourit yo nan chak gwoup ak etè dyetil nan moman 0.5 h, 1 h, 1.5 h, 2 h, 2.5 h, 3 h, 4 h, 6 h, 9. h ak 12 h apre administrasyon pou koleksyon echantiyon.

Plasma te kolekte epi kè a te ekspoze. Perfusion nan saline nòmal nan vantrikul gòch yo te fèt pa yon aparèy perfusion jiskaske fwa a ak poumon yo te blanchi. Lè sa a, yo te kolekte ipotalamus la ak tèstikul pou detèmine konsantrasyon tisi ECH yo(Echinacoside soti nan cistanche).

Eksperyans 3. Sourit yo te owaza divize an 4 gwoup, sèt nan chak gwoup. ECH(Echinacoside soti nan cistanche)ak BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, Lachin) yo te administre lè l sèvi avèk yon tib entragastric yon fwa chak jou pandan 6 semèn dapre konsepsyon eksperimantal sa a: gwoup nòmal (lwil mayi, 10 mL/kg, bw/). d), gwoup modèl: BPA gwoup (BPA 200 mg/kg, bw/d, mayi lwil oliv), ak gwoup eksperimantal: BPA plis ECH gwoup (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg).

Apre 42 jou tretman, sourit yo te anestezi ak etè dyetil epi yo te kolekte echantiyon san yo pou analiz nivo òmòn yo. Epididim tèstikul ak cauda yo te separe epi kolekte. Yo te itilize epididim cauda pou evalyasyon kalite espèm yo epi yo te jele tèstikul la nan nitwojèn likid epi estoke nan -80 degre pou plis envestigasyon.

Figi 7. Pathways reglemante pa chwazi òmòn aks HPG ki gen rapò ak pwoteyin nan repwodiksyon gason jan yo prevwa pa Pathway Ontology Database ak KEGG Pathway Database.

Nòt: Pwosesis reglemante yo reprezante pa orijin diferan koulè ak fòm, epi evènman regilasyon yo parèt lè l sèvi avèk flèch ak liy.

Referans ki lye ak chak pwoteyin yo te baze sou Pathway Ontology Database ak KEGG Pathway Database, epi yo pa nan lis la.

Detèminasyon kalite espèm. Preparasyon sispansyon espèm. Epididymid Cauda yo te mens nan 5 mL nan saline nòmal ak 5 pousan BSA ak enkubasyon pou 5 min nan 37 degre pou pèmèt sa yo gaye nan mwayen an.

Nimewo espèm: Dapre metòd yo dekri nan Yokoi (2003), sispansyon espèm dilye a (1:10; v/v; sispansyon espèm / 10 pousan metanol) te transfere nan chak chanm konte nan yon emocytometer epi yo te pèmèt yo kanpe pou 5. min ak Lè sa a, konte anba yon mikwoskòp limyè (Nikon, Instruments Inc., Japon) nan agrandisman X200.

Viabilite espèm: Yo te melanje yon total de 20 μL nan sispansyon espèm ak yon volim egal nan tach eosin-nigrosin pou 2 min; espèm yo san tache yo te konte anba yon mikwoskòp limyè nan 200x agrandisman.

Motilite espèm: Yo te mete yon total de 10 μL nan sispansyon espèm sou yon glisad vè epi yo te anrejistre kòm swa mobil oswa imobil anba yon mikwoskòp limyè nan 200x agrandisman.

Detèminasyon nivo òmòn yo. Nivo testostewòn (T) ak LH yo te quantifye nan serom, ansefal plis pitwitèr ak omojèn tèstikul lè l sèvi avèk radioimmunoassay (RIA) twous (Beijing Sino-UK Enstiti Teknoloji Byolojik, Beijing, Lachin). Yon ti tan, anti-testostewòn oswa anti-LH IgG antikò (100 μL) ak 125-I-konjige anti-sourit antikò yo te ajoute nan echantiyon oswa estanda a (100 μL), epi melanje sou yon rokeur lannwit lan nan 4 degre. Apre lave twa fwa ak PBS-Tween 20 (500 μL), melanj yo te santrifuje (3500 rpm / min) nan 4 degre pou 15 min. Valè CPM precipitates yo te evalye pa radyoimmunoassay enstriman (Beijing Sino-western Technology Co Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Beijing, Lachin) ak konsantrasyon yo nan T ak LH yo te kalkile dapre fòmil la nan yon estanda. koub. T ak LH koyefisyan varyasyon se 2.8 pousan ak 3.2 pousan nan gwoup echantiyon yo, ak 2.1 pousan ak 2.8 pousan nan gwoup estanda, respektivman.

Detèminasyon ekspresyon jèn pa PCR quantitative an tan reyèl. Total RNA te izole nan jele testikil ak ansefal plis tisi pitwitè lè l sèvi avèk yon twous RNA Senp Total RNA (Tiangen, Beijing, Lachin). Quantitative PCR an tan reyèl (q RT-PCR) te pote soti pou anplifikasyon nan cDNA lè l sèvi avèk 2 × SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, Lachin). Pwosedi PCR la konsiste de 95 degre pou 30 segonn ki te swiv pa 35 sik 95 degre pou 15 segonn, 58 degre pou 30 segonn ak 72 degre pou 30 segonn. Analiz koub k ap fonn yo te fèt sou pwodwi PCR yo pou verifye spesifik primè ak pite pwodwi yo. Yo te fè yon koub disosyasyon pou chak plak pou konfime pwodiksyon yon sèl pwodwi. Yo te kalkile abondans relatif chak mRNA. Yo montre premye PCR yo itilize pou etid la nan Tablo 2.

Western blot. Pou analiz ekspresyon AR, yo te fè ekstraksyon ak izolasyon sitoplasmik ak pwoteyin nikleyè lè l sèvi avèk yon Twous Ekstraksyon Sitoplasmik ak Pwoteyin Nikleyè (Beyotime, Nanjing, Lachin) dapre enstriksyon manifakti a. Yo te evalye konsantrasyon yo nan pwoteyin sitoplasmik ak nikleyè lè l sèvi avèk yon Twous Test Pwoteyin Bradford (Beyotime, Jiangsu, Lachin). Echantiyon pwoteyin (80 ug) yo te kouri sou yon 12 pousan ak 5 pousan jèl SDS-PAGE epi yo te transfere sou manbràn PVDF. Apre bloke, manbràn yo te enkube ak antikò anti-AR IgG (1:1, 000; Bioss; Beijing Lachin), ak antikò poliklonal sourit anti-GAPDH (1:1, 000; Wuhan Boster). ByolojikTeknoloji, Wuhan, Lachin) oswa sourit poliklonal anti-Lamin b1 antikò pou 2 h. Yo te lave manbràn la twa fwa ak TBST epi enkube ak yon antikò IgG lapen anti-sourit HRP-konjige (1:5, 000; Bioss; Beijing Lachin). Siyal la te vizyalize lè l sèvi avèk ChemiDoc Imaging System (Tanon -3, 500, Shanghai, Lachin).

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) tès. Yo te kolekte san nan tib an vè eparinize. Plasma a te separe pa santrifujasyon imedya a 6,000 rpm pou 10 min epi estoke nan -20 degre pou plis eksperyans. Echantiyon ipotalamus yo ak tèstikul yo soti nan chak pwen tan yo te pisin ak omojeneize ak metanol. Apre santrifujasyon nan 10, 000 rpm nan 4 degre pou 10 min, supernatant la te konsantre pa N2 epi rezidi a te fonn nan 50 μL metanol epi filtre nan yon fltè 0.45 μm. Yo te enjekte dis μL echantiyon likid la filtre nan sistèm HPLC pou analiz.

Koub estanda a konsiste de echantiyon ki genyen 50, 100, 250, 500 ak 750 ng/mL ECH la.(Echinacoside soti nan cistanche)(Chengdu Pufei De Biotech co, Ltd, Sichuan, Lachin). Echantiyon kontwòl kalite Plasma ki gen 75ng/mL (ba), 150 ng/mL (mwayen) ak 300 ng/mL (segondè) nan ECH la te prepare kòmsadwa pou mezire presizyon ak presizyon metòd la.

Chromatografi yo te fèt ak yon sistèm HPLC (D2{{10}}{00 Elite seri, Hitachi, Japon) makonnen ak yon detektè UV (L{-2400, Hitachi, Japon). Separasyon te fèt sou yon kolòn Thermo-C18 (250 mm × 4.6 mm id, 4.6 μm patikil) kenbe nan 25 degre. Faz mobil lan se te yon gradyan ki te prepare soti nan 0.1 pousan asid fosfò ki gen 0.04 pousan trimethylamine (konpozan A) ak metanol (konpozan B). Gradyan lineyè a te jan sa a: 70–90 pousan A sou 0-2 min, 60–70 pousan A sou 2–6 min, 55–60 pousan B sou 6–8 min epi answit tounen nan 90 pousan A nan 8 min imedyatman. Pousantaj koule a te 0.8 mL / min. Detektè UV a te opere nan 332 nm. Yo te evalye zòn nan pik kòm mezi analitik.

Etid farmakokinetik nan sourit. Pénétration nan ECH(Echinacoside soti nan cistanche)nan ipotalamus la ak tèstikul te sibi analiz pharmacokinetic ak dwòg ak Estatistik lojisyèl (Dwòg ak Estatistik, Matematik Farmakoloji Komite Pwofesyonèl nan Lachin). Paramèt farmakokinetik yo te detèmine lè l sèvi avèk metòd ki pa konpatiman ki baze sou teyori moman estatistik. Paramèt farmakokinetik preliminè yo enkli tan pou pik konstan (Tmax), pik konsantrasyon (Cmax), to eliminasyon konstan (Ke), mwatye lavi eliminasyon (T0.5), zòn ki anba koub la (AUC{). {4}}–12), volim distribisyon aparan (Vc), ak clearance (CL) yo te jwenn pou plis analiz. Pwopòsyon sèvo/plasma yo te kalkile dapre valè AUC0-t pou plasma ak sèvo.

ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) sentèz ak idantifikasyon. Yon total de 9.8 mg nan ECH(Echinacoside soti nan cistanche)ak 1.0 mg nan anidrid butanediol yo te fonn nan 2 mL piridin, melanje pou 12 èdtan ak brase nan tanperati chanm. Te melanj lan konsantre pa N2 ak rezidi a te konbine avèk 10.8 mg nan N-hydroxysuccinimide (NHS) ak 19.3 mg nan dicyclohexylcarbodiimide (DCC) ak fonn nan 4 mL N, N-dimethylformamide (DMF) pou 12 èdtan ak brase nan tanperati chanm. . Apre santrifujasyon nan 2,000 g pou 5 min nan 4 degre, supernatant la te ajoute nan 5 mL PBS nan ki te fonn 14.4 mg ovalbumin (OVA). Nouvo melanj lan te brase pou 24 èdtan nan 4 degre. Lè sa a, solisyon reyaksyon an te dyalize kont PBS pou twa jou. Prezans ECH-OVA te konfime pa UV spectre (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) nan yon longèdonn sòti nan 190 a 400 nm osi byen ke pa denaturasyon PAGE.

ELISA endirèk (iELISA). Yon plak mikrotiter te kouvwi ak ECH-OVA a (2 ug/100 μL) epi enkube lannwit lan nan 4 degre. Plak la te lave twa fwa ak PBST ak de fwa ak PBS; epi yo te ajoute 5 pousan PBSM (PBS ki gen 5 pousan lèt ekreme) pou bloke sit ki pa mare yo nan 37 degre pou 2 èdtan. Apre plak yo te lave ak PBST ak PBS, pwi yo te divize an 4 gwoup; gwoup eksperimantal, 1 ug AR total pwoteyin / 100 μL; gwoup pozitif, antikò lapen anti-OVA (1:1, 000); gwoup negatif, 1 ug albumin serom bovin; ak yon gwoup vid ki gen PBS. Apre enkubasyon pou 1.5 èdtan, plak yo te lave, epi yo te ajoute 100 μL / byen nan lapen HRP-konjige IgG (1: 1, 000) nan gwoup la pozitif, yo te ajoute 100 μL / byen nan anti-AR. (1:1,000) bay lòt gwoup yo. Apre enkubasyon pou 1.5 èdtan, yo te ajoute dilution IgG lapen HRP-konjige (1:5,000) nan plak yo. Apre enkubasyon nan 37 degre pou 1 èdtan, plak yo te lave twa fwa ak PBST ak de fwa ak PBS. Lè sa a, TMB te ajoute ak enkube pou 10 min nan fè nwa a nan tanperati chanm ak 2 M H2SO4 te ajoute yo sispann reyaksyon an. Absorbans la te li nan yon longèdonn 450 nm.

Docking molekilè. Yo te fè yon etid molekilè pou mennen ankèt sou mòd obligatwa ECH konpoze an(Echinacoside soti nan cistanche)nan reseptè androjèn imen (AR) lè l sèvi avèk Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). Estrikti ki genyen twa dimansyon (3D) AR (PDB ID: 2YHD) te telechaje nan Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). ChemBioDraw Ultra 14.0 ak ChemBio 3D Ultra 14.0 lojisyèl te jwenn estrikti 3D ECH la. Pake AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu) te anplwaye pou jenere fichye D' docking yo. Kadriyaj rechèch AR a te idantifye kòm sant x: 36.141, sant y: 8.513, ak sant z:

21.304 ak dimansyon gwosè x: 15, gwosè y: 15, ak gwosè z: 15. Yo te mete valè exhaustiveness a 20. Pou vina debakadè, yo te itilize paramèt default yo si li pa te mansyone. Yo te chwazi pozisyon ki pi byen fè nòt la jan yo jije dapre nòt ancrage Vina yo epi yo te analize vizyèlman lè l sèvi avèk lojisyèl PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org).

Analiz done ak metòd estatistik. Done yo te analize ak lojisyèl estatistik SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Yo te itilize yon ANOVA yon sèl-fason pou konparezon nan mitan gwoup yo. Tès konparezon Tukey a nan diferans enpòtan nan mitan gwoup yo te detèmine. Rezilta yo te eksprime kòm mwayen ± devyasyon estanda (SD) lè l sèvi avèk Graph Pad Prism lojisyèl v.7 (GraphPad Software, Inc, Kalifòni, USA).

Apwobasyon etik ak konsantman pou patisipe. Yo te jwenn apwobasyon etik pou etid sa a nan Komite Etik Anyang Enstiti Teknoloji.

Referans

1. Cano, SN, Misra, M. & Ackerman, KE Egzèsis, fòmasyon, ak aks ipotalamik-pitwitèr-gonadal nan gason ak fanm.Front. Horm. Res. 47, 27–43 (2016).

2. Papadopoulos, V. & Miller, WL Wòl mitokondri nan steroidogenesis. Pi bon Pratik. Res. Cl. En. 26, 771–790 (2012).

3. Rone, MB et al. Idantifikasyon yon konplèks pwoteyin mitokondriyo dinamik ki mennen nan enpòte kolestewòl, trafik, ak metabolis nan yon òmòn esteroyid. Mol. Endocrinol. 26, 1868–1882 (2012).

4. Shibari, S., Ylonen, H. & Palme, R. Ekskresyon ak mezi kortikosteron ak metabolit testostewòn nan vole labank (Myodes glareolus). Gen. Comp. Endocrinol. 243, 39–50 (2017).

5. O'Hara, L. et al. Siyal reseptè androjèn pitwitè yo kontwole prolaktin men se pa gonadotwofin nan sourit gason an. PloS youn. 10, e0121657 (2015).

6. Amador, AG, Parkening, TA, Beamer, WG, Bartke, A. & Collins, TJ Testicular LH reseptè ak sikile nivo òmòn nan twa modèl sourit pou maladi eritye (Tfm/y, lit/lit ak hyt/hyt). Endocrinol. Eksp. 20, 349–58 (1986).

7. Bulldan, A., Dietze, R., Shihan, M. & Scheiner-Bobis, G. Siyal testostewòn ki pa klasik medyatè atravè ZIP9 stimul ekspresyon claudin ak fòmasyon junction sere nan selil Sertoli. Selil. Siyal. 28, 1075–85 (2016).

8. Walker, WH Testostewòn siyal ak règleman an nan spermatogenesis. Spèmatogenesis. 1, 116–20 (2011).

9. Cao, C. & Kindscher, K. Chimi medsin nan espès Echinacea (ed. Kindscher, K.) 127-145 (Springer, 2016).

10. Jiang, ZH, Jian, W., Li, XP & Zhang, XYEchinacosideepiCistanche tubulosa (Schenk) R. Wight amelyore bisphenol A-pwovoke tèstikul ak domaj espèm nan rat nan aks gonad reglemante anzim steroidojèn. J. Ethnopharmacol. 193, 321–328 (2016).