PATI I.: Pwosesis enflamatwa modulate ekspresyon ak lokalizasyon nan WT1 nan Podocytes ki mennen nan domaj ren
Mar 23, 2022
Kontak: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com
MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ, PABLO ZAPATA-BENAVIDES & ET AL.
Entodiksyon
Jenèz Wilm-1(WTI) se youn nan jenetik prensipal ki enplike nan siviv nan podocytes ak ensifizan filtraj ren. Pwosesis enflamatwa mennen nanRenechèke sa ka rive nan modilasyon WT1 (WT1)Jenèz Wilm-1). 2015 : WttsJenèz Wilm-1) ankouraje yon faktè transkripsyon, yon pwoteyin dwèt zenk ki gen kat gwo isoforms pa altènatif fann nan exon 5(17AA±)ak exon 9 (KTS±)(1). KTS-isoform gen yon afinite ki pi wo pou ADN, KTS+ ko-lokalize ak pwoteyin fann nan cytoplasm (2, 3). 2015 : WttsJenèz Wilm-1) jwe yon wòl kritik nan anbriyon, sitou nan gonadal akRendevlopman; nan granmotan, ekspresyon li limite a selil vizyèl espesyalize nanRen(podocytes)e li esansyèl pou antretyen ak modile plizyè jene, tankou podocalyxin, nefrin (NPHS1), ak pè-bwat transkripsyon (4-6). Mitasyon oswa rediksyon nan ekspresyon WTL ka mennen nan diminye ekspresyon nan nefrin ak podocalyxin epi li asosye ak nephropathies tankou glomerulosclerosis (5, 7-10).
Sendwòm nephrotik se sendwòm ki pi souvan ren nan anfans, klasifikasyon istolojik li yo se chanjman nephrotik Minimòm, fokal segman glorik, ak difize sclerosis mesangi, ak dapre limit li nan repons lan nan stewoyid klase kòm yon sansib ak rezistan sendwòm nefrotik (11).
Mitasyon nan LengwistikJenèz Wilm-1) se souvan rapòte nan timoun ki gen sendwòm stewoyid ki rezistan nephrotik, yon maladi ki ra ki afekte 10-15% nan pasyan ki gen sendwòm netrotik (12,13). Anviwon 80% nan tout timoun ki gen sendwòm nephrotik nephrotik reponn a tretman stewoyid, sepandan, pa gen okenn mitasyon yo te jwenn nan WT1Jenèz Wilm-1) nan yon gwo etid kowòdone (14). Rediksyon nan ekspresyon nan sendwòm stewoyid-rezistan ak nan yon limit pi piti nan pasyan ki gen sendwòm stewoyid nephrotik nephrotik (15). Nan yon modèl enflamasyon sistemik ki te pwovoke pa lipolisaccharide (LPS), 24 h apre administrasyon LPS, WT1Jenèz Wilm-1yo te tradui nan sipèpoze a epi yo te asosye ak yon diminisyon nan ekspresyon neverin, yon eleman kle pou kenbe dyafram nan ti kras nan podocytes ak esansyèl pou kòrèk filtraj glomeral, kidonk montre WT1Jenèz Wilm-1) aji kòm yon faktè transkripsyonèl pou monte-reglemante jene neverin (16).
Nan selil kansè nan poumon A459 trete ak necrosis necrosis faktè-alfa (TNFA), tralokasyon nan WT1Jenèz Wilm-1) pwoteyin nan cytoplasm te obsève, sijere ke yon estimilis enflamatwa ka chanje lokalizasyon intracellular li yo ak fonksyon transkripsyonèl (17). Fosfotoloji ka jwe yon wòl nan modile aktivite regilasyon transkripsyonèl nan WT1Jenèz Wilm-1) atravè entèferans ak translokasyon nikleyè, osi byen ke pa anpèchman nan WT1Jenèz Wilm-1) ADN-obligasyon (18) pa cAMP-depandan pwoteyin kinase-medyatè fosfò nan Ser-365 ak Ser-393 nan domèn dwèt zenk (19).
Sepsis se yon rezilta nan repons lan enflamatwa sistemik epi li karakterize pa liberasyon an nan pro-ak anti-enflamatwa cytokines pwovoke pa enfeksyon. Egi blesi ren se komen nan pasyan kritik malad nan prezans nan enflamasyon egi e li gen yon lyen fò nan pwogresyon an nan domaj ren kwonik (20,21). Gen prèv ki montre enflamasyon jwe yon wòl enpòtan nan domaj nan divès ògàn, ki gen ladangrenn vant(22). Nan travay sa a, nou evalye efè a nan pro-enflamatwa cytokines sou modilasyon an nan WT1Jenèz Wilm-1) ekspresyon ak translokasyon li yo nan cytoplasm la.
benefis sitàn tublosa : anti-cncer ak anti-kansètimè
Materyèl ak metòd
Modèl bèt. Yo te jwenn fanm BALB / c mice (8-10 semèn) yo te jwenn nan Harland Meksik (Vil Meksik, Meksik). Mis la te kanpe anba tanperati chanm kontwole, imidite, ak limyè (12/12h limyè-nwa) ak dlo ak libit manje anons. LPS nan Escherichia coli O111: B4(Sigma Aldrich, Toluca, Vil Meksik, Meksik)ak yon sèl piki nan LPS te administre nan yon dòz 8 mg/kg intraperitone(16); solisyon saline a te itilize pou kontwòl, mis trete. Mis la te sakrifye ak yon piki enstrimantal nan 200 mg / kg solisyon sodyòm pentobarbital nan 12,24,36,48 ak 72 h, ak n = 5 nan chak pwen, ak Lè sa a,Renyo te ranmase tisi ak san. Pipi a te ranmase pipi a anvan yo te sakrifye bèt yo.
De mis pouReneksplantasyon yo te sou enjekte ak 1 mg / kg nan LPS chak 2 jou pou pwovoke kwonikRen blesi (n)kòm yon kontwòl pozitif (21). Tout eksperyans yo te pote soti an akò ak apwobasyon anvan nan Swen Animal Enstitisyonèl la epi sèvi ak Komite Fakilte Syans Byolojik (CEIBA-2016-034).
Reneksplantasyon. sòti deRennan BALB / c mice, tranch tisi 250-300 um epè yo te prepare ak yon tisi Krumdieck tisi (Alabama Rechèch ak Devlopman, Munford, AL, USA)nan 4 °C ak koule nan tanpon nan krebonik Henseleit (KB) ki te aere ak 5% CO2. Tranch yo te rekòlte nan KB tanpon nan 4 °C.Reneksplantasyon yo te plake nan 12-byen plak ak modifye mwayen Eagle la / F12 mwayen konplete ak 10% sewòm bovine fetal ak 5% antibyotik-antifongal, ak enkyete nan 37 ° CC, ak 5% CO, ak brase nan 25 rpm. Eksplantasyon yo te trete ak 10 ng / ml nan TNFA (R&D Sistèm, Minneapolis, MN, USA), 20 ng / ml nan interleukin 1β (IL1β; R &D Sistèm) ak 100 ng / ml nan LPS ak analize nan 6, 12 ak 24 h pita.
Pwoteyin nan urin. Echantiyon piran yo te ranmase nan chak fwa pi wo a. Konsantrasyon pwoteyin la te mezire lè l sèvi avèk twous la DC Protein Aza (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)ak albuminia te evalye lè l sèvi avèk dodecyl odyòm-polyacrylamide elektwofòn jèl ak ki baze sou gwosè a nan albòm serum bovine (16).
Pro-enflamatwa cytokines. Nivo IL6, IL1β, ak TNFa te mezire lè l sèvi avèk sandwich anzim-lye immunosorbent (PeproTech, Vil Meksik, Meksik).
Quantitative polymerase chèn (qPCR). Total RNA te izole nan tisi ren lè l sèvi avèk Trizolw Reagent (Envitrogen, Carlsbad, CA, USA)selon enstriksyon manifakti a. Yon sèl-branche CDNA te sentèz pa transkripsyon ranvèse lè l sèvi avèk Segondè Kapasite CDNA Ranvèse Kit (Aplike Biostems, Foster City, CA, USA)dapre enstriksyon manifakti a. PCR an tan reyèl te fèt lè l sèvi avèk sistèm nan 7500 PCR An tan reyèl (Aplike Biostems) ak taqman ekspresyon jenere. Konparativ an tan reyèl PCR te fèt pou chak echantiyon nan triplicate. Primè yo pou WT1Jenèz Wilm-1) te pi devan: 5-TCTGCGG AGCCAATACAG-3'; ranvèse: 5-CACATCCTGAATGAATGCTGAATGACT GAAGA-3'; ak probe FAM: 5-CACCGTGTGTGTTATT-3'NFQ;pwotokòl la te fèt pou 95 ° C pou 10 min ak 40 sik nan 94 ° Cfor 30 s ak 64 ° CC pou 30s yo. Papa ayisyen, relatif nan WT1.Jenèz Wilm-1) te gene te kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon an 2-AACT (23) ak glikèrdehyde-3-fosfat dezidrogenase (GAPDH) jenetik (Applied Biostems) ke yo te itilize pou nòmalizasyon.
trete maladi ren ki sispann ekstrè
Ekspresyon nephrin MRNA te detèmine ak 3 griye nan CDNA ak primè sa yo: Pi devan: 5'CCCAACATCG ACTTCATT-3'ak ranvèse: 5-GGCAGGACATCATGA 94°C pou 30 s,60 ° C pou 30 s ak 72 ° C ° C ° C pou 30s pou 30 sik (372 bp)(16). Pou ekspresyon gapDH, primè yo te itilize: Forward: 5'ACCAGTCCATCATCATCAC-3', ranvèse: 5'TCCACCCC TGTTGCTGTA-3', ak kondisyon reyaksyon sa yo: 94 °C pou 40s,60 °C pou 30s ak 72 °C for40s pou 35 sik (452 bp). Li genyen (2002) 21.111 moun, nan lane 200Jenèz Wilm-1(: Forward 5'-CACATGAGAGACCCCCCCCTTCATGTG-3', ranvèse 5'-TTTGAGCTGACTGAGAGAGAGAGAGAGAA-3'at 94 °C pou 40 s, 64 °C pou 30s ak 72 ° Cfor 30s pou 35 sik (160 bp). Li genyen (2002) 1.111 moun, nan lane 2005, li vinJenèz Wilm-1) isoforms KTS±and 17 AA± (F2-R2 primè yo detekte 17 AA +/-ak F3-R3 pou detekte KTS +/-splicing isoforms)et.al. (24). Detèminasyon an nan ekspresyon an nan β-actin te fèt dapre Lauxet al. (25). Pwodwi yo te obsève lè l sèvi avèk 10% polyacrylamide elektwofòn pou KTS±isoform ak yon 2% agarose jèl pou 17AA±isoform.
Immunofluorescence. grenn vantsoti nan LPS-trete mis ak kontwòl yo te fiks nan fòmil 10% ak trete pou ematoksiklin ak eosin tach, iminohisto chimi, ak iminofluoresans.
Pou detèmine ki kote WT1 yeJenèz Wilm-1) nan mikwoskòp trete ak LPS, 4-um-epè seksyon nan tisi ren monte sou glisad mikwoskòp yo te itilize. Echantiyon yo te dewaxed, pèmebilize ak Triton X-100 [0.1% Triton ak 1% site sodyòm nan saline fosfat-afekte (PBS)] ak lave twa fwa ak PBS. Tisi yo te bloke ak 20% sewòm bovine fetal nan PBS pou 30 min ak enkoni nan 4 °C lannwit ak antikò monoklon nan WT1Jenèz Wilm-1) sc-7585(F-6)(Santa Cruz Biyoteknoloji, Santa Cruz, CA, USA), dilye 1:100 nan 10%fetal serom bovine nan PBS. Aprè lave ak PBS, prezans nan antikò mare te idantifye pa tach ak kabrit anti-sourit IgG Texas Wouj sc-2979 (Santa Cruz Biyoteknoloji). Glise yo te kontrepwann ak 4,6-diamidino-2-fen. Finalman, glise yo te monte ak kalitativman egzamine lè l sèvi avèk yon Olympus BX61W1 konfo mikwoskòp ak yon 40× dlo imèsyon objektif ak Fluoview 4.0a lojisyèl (Olympus, Tokyo, Japon).
Immunohistochemistry. Pou detèmine fosfoloji (p)-WT1Jenèz Wilm-1) nan podocytes soti nan LPS-trete, antikò politik p-WT1 (Jenèz Wilm-1) serine 393, sc-12933 ak 363,sc-12934-R (Santa Cruz Biyoteknoloji, Dallas, TX, USA) yo te itilize. Glise ki gen seksyon 4-μm nan tisi ren yo te dekouraje ak perméabilized. Immunohistochemistry te fèt lè l sèvi avèk Inivèsèl Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)dapre pwotokòl manifakti a. Glise yo te egzamine lè l sèvi avèk yon mikwoskòp limyè ak yon objektif imèsyon× lwil oliv (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Almay).
Blot oksidantal. Pwoteyin total te izole ak 200 μl nan lysis tanpon (1%Triton,150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCL pH 7.6), ak konsantrasyon an te mezire lè l sèvi avèk yon twous DC Protein Assay (Bio-Rad). Pwoteyin (50 ug) te separe lè l sèvi avèk 12% odyòm dodecyl sulfate-polyacrylamide jèl elektwofòn ak analize pa blokaj lwès ak WT1Jenèz Wilm-1[ F6] antikò sc-7585 (Santa Cruz Biyoteknoloji). Echantiyon yo te nòmalize lè l sèvi avèk anti-GAPDH (AB2302; Sigma, San Louis, MO, USA). Pwoteyin yo te visualized lè l sèvi avèk yon sistèm Lumi-Limyè sistèm blotting sistèm sc-2048 (Santa Cruz Biyoteknoloji).
benefis nan cistanche: pwoteje ren
Rezilta
Endiksyon deRenDomajnan BALB / c mice pa LPS.It se byen etabli ke blesi podocyte ki asosye ak ogmante protéines. Albumin ak pwoteyin total nan pipi te detèmine pa dodecyl sulfate-polyacrylamide jel elektwofònezyen DC Protein Assay (Bio-Rad). Yon ogmantasyon siyifikatif (p = 0.001) nan albumin urin te obsève 12 h apre Tretman LPS, ak yon ogmantasyon maksimòm nan 24 h(215.87±1.41 ug /ml) konpare ak kontwòl la (15.53±5.0 μg /ml). Konsantrasyon nan pwoteyin pipi total te obsève nan pik nan 36 h (26.02±2.43 mg / ml) e li te siyifikativman pi wo konpare ak kontwòl la (p =0.01) jan yo montre nan Figi 1. Domaj ren ki te pwovoke pa LPS te analize pa istoloji. Nan 24 h apre tretman an, fokal glomeralphrie te obsève nan tisi ren, ak pi gwo domaj yo te jwenn nan 36 h, ogmante gwosè a nan glomeral la, ak pwopagasyon selil mesyanjal. Nan 48 h apre, yon rekiperasyon gradyèl nan glomeral la li te obsève jouk 72 h, jan yo montre nan Figi 1C.
Figi 1. Efè enflamasyon sistemik sou ren an.Konsantrasyon nan albumin (A) ak pwoteyin pipi (B)kòm makè nan domaj ren nan mitan trete ak lipolisaccharide. C: Yon imaj reprezantan nan istwa ren nan sourit (ematoksilin ak eosin tach) nan diferan moman (12,24,36,48, ak 72 h)apre lipolisaccharide piki, ak konparezon an nan yon modèl nan enflamasyon kwonik, mayifikasyon 100×. Siyifikativman diferan nan: *nèf<><0,0]><0.00>
Pwodiksyon nan cytokines pro-enflamatwa tNFa ak IL1βin sewòm soti nan LPS-trete mis. Pou konfime domaj ren te pwovoke pa LPS, pro-enflamatwa nivo cytokines yo te mezire pa anzim-lye iminosorbent aza. Yon ogmantasyon nan TNFa ak I1β te obsève apre 12 h (3.6±0.9 ng / ml, 11.9±5ng / ml) ak jiska 36h (4.44±0.1 ng/ ml,18±0.9 ng / ml respektivman)nan tretman ak LPS, kòmanse refize apre sa (Figi 2A ak B). Ekspresyon IL6 te ogmante nan 12 h (49.5 ng / ml) ak 36 h (23.5 ng / ml) pòs-tretman, yo te siyifikativman pi wo pase kontwòl la (Figi 2C).
Figi 2. Kou tan nan nivo nan pro-enflamatwa cytokines timè necrosis faktè-alfa (TNFa).(A), interleukin 1β (LL1β)(B), ak IL6 (C) nan serom soti nan mitan administrasyon intraperitoneal nan lipolisaccharide. Siyifikativman diferan nan: *p≤0.05,*p≤0.01 ak ***p≤0.001.
WTI ekspresyon jenetik nan tisi ren soti nanlPS-trete mis. Pou reponn kesyon santral nou an si WT1Jenèz Wilm-1) te modile pa pwosesis la enflamatwa, e sa te gen efè ren, ekspresyon total WT1 laJenèz Wilm-1) jene te detèmine nan echantiyon ren soti nan mis ak enflamasyon sistemik nan diferan moman nan kou a nan enflamasyon. 2015 : WttsJenèz Wilm-1) MRNA te pi ba nan tout tan analize ki gen rapò ak kontwòl la, ak ekspresyon ki pi ba nan 36 h ak pi wo a nan 12 h apre endiksyon nan enflamasyon sistematik jan yo montre nan Figi 3A. Anplis de sa, li te detèmine si tretman an ak LPS pwovoke modifikasyon nan ekspresyon an nan ekspresyon an izofòm (17 AA±) ak KTS±of WTI pa PCR. Done yo te montre ke pa te gen okenn degre nan ekspresyon an nan sa yo isoform kòm konpòtman an menm te obsève kòm gwoup la kontwòl san tretman nan tout pwosesis enflamatwa sistematik ki pwovoke pa LPS (Figi 3B). Pwoteyin WT1 te montre pa blokaj lwès diminye nan tout pwosesis enflamatwa a, ak yon rekiperasyon ti tay nan 36 h apre tretman, sepandan, kantite lajan an nan WT1 te mwens pase sa yo ki an kontwòl la trete (Figi 3C ak D).
Figi 3. Efè lipolysaccharide (LPS)sou Wilms'timè I (WT1) ekspresyon jenetik nan tisi ren soti nan mis ak enflamasyon sistemik.A: Ekspresyon relatif nan WTI MRNA.B: Ekspresyon relatif nan isoforms KTS±and 17IAA±of WT1. C: Nivo nan WTI pwoteyin pa iminoblotting apre LPS tretman ak D: Dansite nan iminoblotting pou WT1. Siyifikativman diferan nan:**p≤0.01 ak ***p≤0.001,
Fosfò ak lokalizasyon nan WTI nan byopsi ren nan LPS-trete mice. Yon evènman enpòtan nan modilasyon an pòs-tradiksyon nan pwoteyin WTI se fosfò nan asid amine 393, ki pwovoke deplasman an nan pwoteyin la nan sitoplas la. Fosfò ak lokalizasyon nan WT1 nan echantiyon ren soti nan mitan trete ak LPS yo te detèmine. Fosfò nan WT1 te analize pa istwa, ki endike prezans nan fosfosye WT1 nan cytoplasm nan selil yo nan seksyon yo nan tisi ren kòmanse 12 h apre endiksyon an nan enflamasyon sistemik epi yo te kenbe jouk 72 h.WT1 te fosforize nan asid amine 393 ak 363 jan yo montre nan Figi 4A. Kote pwoteyin WT1 la te analize pa iminofliyans. Kote a nan WT1 nan podocytes nan echantiyon ren soti nan LPS-trete te sitou cytoplasmic, Tandiske nan podocytes yo soti nan echantiyon yo kontwòl, kote a te klè (Figi 4B).
Figi 4. Fosfò ak lokalizasyon nan Wilms 'timè I (WTI) nan echantiyon ren soti nan lipolisaccharide-trete mice.A: Immunohistochemical tach pou fosfò (p)-WTI ki montre yon ogmantasyon nan fosfò nan serine 393 ak 363 kòmanse 12 h apre administrasyon LPS (mayifikasyon 100× sou limyè mikwoskòp la). B: Lokalizasyon WTI pa imunofluoresans nan ren an; egzanp ki montre lokalizasyon nikleyè minè nan WT1 (kare) 36 h apre administrasyon an nan lipolisaccharide (mayifikasyon 40× sou mikwoskòp la konfo). DAP1:4,6-Diamidino-2-phenylindole.
Modilasyon nan ekspresyon WTI ak neve nan ren ki soti nan LPS-trete mice. WT1 kote nan selil a enfliyanse aktivite byolojik li yo. Li te rapòte ke cytoplasmic WT1 pa fè egzèsis aktivite transkripsyonèl; pou rezon sa a, ekspresyon WT1 ak nephrin MRNA te analize pa PCR nan echantiyon ren soti nan mitan trete ak LPS (Figi 5A). PCR endike yon diminisyon nan RNA nephrin soti nan 24 a 48 h, ak yon ogmantasyon nan 72 h (Figi 5B), pandan y ap ekspresyon an nan WTI MRNA ogmante nan 12 h ak apre sa refize pandan lè yo kritik nan enflamasyon ak domaj ren (24 ak 36 h) ak (Figi 5B).
Figi 5. Analiz de neverin (NPHS1) ak Wilms pa pi gwo ekspresyon 1 (WT1)mRNA ekspresyon.A: Nan analiz la nan ekspresyon MRNA, NPHSI ak WTI diminye nan 24,36 ak 48 h apre endiksyon an nan enflamasyon sistemik lè l sèvi avèk lipolisaccharide. B: Quantifikasyon nan gwoup yo montre nan A pa dansitometri ak nòmalize pa ekspresyon glyceraldeyde 3-fosfat dehydrogenase.
Ren eksplantasyon trete ak TNFa ak IL1β modile ekspresyon an nan WTI ak neverin. Pou detèmine si cytokines yo modile ekspresyon an nan WT1, eksplantasyon ren yo te kiltire ak trete ak cytokines TNFa ak IL1βfor 6,12, ak 24 h analize ekspresyon an nan WT1 ak neve pa PCR. Nephrin MRNA ekspresyon diminye ak WTI MRNA ekspresyon ogmante nan 24 h nan eksplantasyon ren trete ak TNFa ak ILlb (Figi 6).
Figi 6.Analiz de ekspresyon nephrin (NPHS1) ak Wilms 'timè 1 (WT1) mRNA nan eksplantasyon ren.A: MRNA ekspresyon nivo NPHSI ak WTI nan diferan moman nan eksplantasyon ren ekspoze a 10 ng / ml nan nekroz faktè-alfabetizasyon (TNFα), ak 20 nglove lavi mwen nan interleukin 16 (IL16)B: Ekspresyon relatif jwenn lè l sèvi avèk analiz dansitometrik nan pwodwi siyal la. Gwoup sa yo te kalkile pa nòmalizasyon pou glise 3-fosfò dezidwojèn.
Lokalizasyon nan WTI nan eksplantasyon ren pa iminofluoresans. Pou detèmine si TNFa ak ILβ te responsab pou chanjman nan lokalizasyon pwoteyin WT1, eksplantasyon sourit ren yo te trete ak TNFa ak L1β ak LPS pou 24 h. Nan eksplantasyon trete ak ILlb ak LPS, yon lokalizasyon nan nwayo / cytoplasmic nan pwoteyin WTL te aparan, ak nan eksplantasyon yo trete ak TNFa, lokalizasyon siplasmik nan pwoteyin WT1 te obsève; pandan se tan, nan kontwòl san trete, sitou lokalizasyon nikleyè nan WT1 te obsève (Figi 7).
Figi 7. Lokalizasyon nan Wilms'timè 1(WTI) pwoteyin pa iminofluorescence lè l sèvi avèk TX Wouj (WT1) ak 4',6-diamidino-2-fenomèn (DAPI) (nucleus) nan podocy eksplantasyon ren trete ak l0 ng / ml nan nekroz faktè nekroz faktè-alfa (TNFA), 20 ng / ml nan interleukin 16 (L1B), ak lipolysaccharide (LPS).Redwi lokalizasyon nikleyè nan WTas montre nan eksplantasyon yo trete ak TNFa konpare ak lokalizasyon nikleyè / cytoplasmic nan WTI anba IL1β ak Tretman LPS. Manyifikasyon, 40×.
