Efè pwoteksyon ak mekanis prokyans sou maladi Parkinson la nan Vivo ak nan Pati Vitro 2

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

2.7.Efè PC sou estrès oksidantal nan Zebrafish Larae trete ak MPTP

Tretman nan zèb lav ak PCs diminye MPTP-induit ogmante fòmasyon ROS intracellar (Figi 7a,b). Anplis de sa, rezilta yo aza lipid pèsoksidasyon te montre ke PC ekspoze (16 μg / mL)bloke nivo MPTP-induit MDA nan zèb lav (Figi 7c). Anplis de sa, rediksyon MPTP-induit nan aktivite GSH-Px te ranvèse pa PC(16 μg / mL) tretman (Figi 7d), ak PCs (4,8, ak 16 ug / ml) ogmante MPTP-induit diminye nan CAT ak AKTIVITE SOD (Figi 7e,f).

Figi 7. Efè PC yo sou estrès oksidantal nan zèv lav trete ak MPTP. (a) Nivo ROS yo te mezire pa mikwoskòp fluorescent ak imajinasyon analiz;(b)roS nivo yo te mezire atravè lojisyèl imajJ;(c) MDA nivo;(d) GSH-Pxactivity;(e)CATActivity;(f) AKtivite SOD. F ak valè nan analiz la yon sèl-fason nan divèjans yo prezante pi wo a chak tablo. Rezilta tès pòs Tukey a prezante pou konparezon chwazi: ns, p>0.05;*,p<><0.01;***, p=""><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Tanpri klike isit la pou aprann plis

2.8. Efè PC sou Nr2 / YO PAtlhroay nan MPTP-induit Zebrafish Laroa

Tretman nan zèv lav ak PCs souliye lokal la ki aktivasyon nan Nr2 / ARE chemen te patisipe nan pwopriyete PC-medyatè pwoteksyon. Ekspresyon an nan Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC ak GCLM makè te monte pa Tretman PC konpare ak Ekspoze MPTP pou kont li (Figi 8a-e).

Figi 8. Efè PC yo sou Nrf2 / YO chemen nan MPTP-induit zèb lavabo. (a) Nrf2 nivo;(b)HO-1 nivo;(c) NQO1 nivo;(d) GCLCle nivo;(e) nivo GCLM. F ak valè nan analiz la yon sèl-fason nan divèjans yo prezante pi wo a chak tablo. Rezilta tès pòs Tukey a prezante pou konparezon chwazi: ns,p>0.05;*,p<><><0.001:the error="" bars="" are="">

3. Diskisyon

PCs ekspoze kapasite radikal fò ak aktivite antioksidan, ak estrès oksidantif, ki te koze pa jenerasyon an twòp nan ROS oswa / ak sistèm nan antioksidan antioksidan, jwe yon wòl enpòtan nan PD [37-39]. Sepandan, si PC yo ka jwe yon wòl nerotektif nan efè antioksidan rete klè. Rechèch sa a vize mennen ankèt sou mekanis molekilè nan PC kont MPP +/MPTP-induit modèl PD.

Cistanche ka amelyore iminite

Nan etid sa a, konpare ak gwoup la MPP +/MPTP-pou kont li, PC yo make leve nivo aktivite a nan anzim antioksidan (ki gen ladan GSH-Px, CAT, ak SOD) ak diminye nivo nan ROS ak MDA. Rezilta aktyèl yo konsistan avèk yon etid anvan ki sijere ke yon sipleman PC ki ba atravè rejim alimantè amelyore aktivite yo nan GSH-Px, CAT, ak SOD nan pil sevre [40]. Yon lòt etid tou sijere ke PC siyifikativman ogmante CAT ak aktivite SOD ak diminye kontni MDA, konsa amelyore bon jan kalite a nan espèm kabrit [41]. Rezilta sa yo sijere ke PC gen yon efè pwoteksyon sou domaj oksidantif nan selil nè. Anplis de sa, PC yo amelyore vizibilite selil konpare ak gwoup la MPP +-pou kont li nan MPP +-induit selil PC12, make ogmante distans total deplase, ak diminye TH + dansite selil relatif nan gwoup la MPTP-induit zèb. Done sa yo endike ke PC yo gen yon efè pwoteksyon sou selil nè.

Nou plis obsève ke PC siyifikativman ogmante akimilasyon nikleyè Nrf2 konpare ak sa yo ki nan MPP + pou kont li nan selil PC12. Vreman vre, PC yo make moute nivo yo ekspresyon nan NQO1, HO-1, GCLM, ak GCLC[42]. Anplis de sa, Nfr2gene silencing atravè Nrf2 siRNA te itilize pou mennen ankèt sou wòl nan Nrf2 / YO aktivasyon nan PCS-medyatè neroptection kont MPP +-induit domaj oksidantal: Nrf2-siRNA-transfere selil ki endike yon diminisyon make nan Ekspresyon Nrf2. Etid aktyèl sa a te jwenn tou ke Nrf2 frape aboli tou de PC-medyatè pwoteksyon kont MPP +-trete andikap nan vizibilite selil ak efè antioksidan nan PC yo. Rezilta sa yo konsistan avèk yon etid anvan sijere ke amelyore aktivasyon nan chemen Nrf2 / YO kontribye nan neroprotection [43].

Chemen Nrf2/ARE a se yon chemen antioksidan enpòtan [44-46]. Nòmalman, Nrf2 abite nan cytoplasm la, kote li mare nan pwoteyin la inhibition, Keapl [47,48]. Lè selil yo sibi estrès oksidantal, Nrf2 dissociates soti nan Keap1, inisye sistèm defans antioksidan antioksidan antioksidan, ak imedyatman translokasyon nan nwayo a [46,49,50]. Li Lè sa a, reyaji ak ARE yo aktive yon seri de jenewozite selil-pwoteksyon ak antioksidan, ki gen ladan GCLC, GCLM, NQO1, ak HO-1 [51-54]. An repons a estrès oksidantal, Nrf2 dissociates soti nan Keap1 nan cytosol la epi li se Lè sa a, tradui nan nwayo a, obligatwa nan sekans YO yo aktive transkripsyon nan jenetik kript [53-58]. Rezilta aktyèl yo endike ke PC yo ka aktive chemen Nrf2 / YO, transfere Nrf2 soti nan cytoplasm nan nwayo a, akimile nan nwayo a, moute ekspresyon an nan GCLC, GCLM, NOO1, ak HO-1 ak amelyore kapasite nan selil yo reziste estrès oksidantal. Vreman vre, chemen Nrf2 / YO ka reprezante yon sib famasi nan PC yo pou prevansyon PD.

4. Materyèl ak metòd

4.1. Konpoze chimik ak Reyaksyon

MPP+ ak MPTP ajan yo te achte nan Sigma (St Louis, MO, USA), ak Selil Konte Kit-8 te jwenn nan Beyotime (Shanghai, Lachin). PC yo,2', 7/-Dichlorofluorescin dyacet, MDA, GSH-Px, SOD, ak twous cat dyagnostik yo tout te jwenn nan Solarbio (Beijing, Lachin). RNAiso Plus, PrimeScriptTMRT Kit ak GDNA Eraser, ak SYBRPremix Ex TaqTMII.I te achte nan Takara (Shiga, Japon); Nrf2-SIRNA, kontwòl-siRNA, ak Lipofectamine 2000 yo te jwenn nan Jenèv (Shanghai, Lachin). Finalman, antikò prensipal yo, Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD (P): NQO1, Lamin B, GAPDH, Antityrosine Hydroxylase (TH), ak korespondan antikò segondè yo te jwenn nan Pwoteyin (Wuhan, Lachin).

4.2.Kilti selil

Selil PC12 yo te jwenn nan Koleksyon Nasyonal la nan Kilti Selil Natif natal. Selil yo te konsève nan DMEM konplete ak 10% sewòm bovine fetis ak penisilin-streptomycine (100 U / mL; 100 ug / mL) nan yon enkibatè atmosfè imedyatman nan 37 ° C ak 5% CO2 [59].

4.3. Selil Viability Assay

PC12cells (1×104 selil / byen)yo te incubated ak 1,2or4ug / mLof PCsor deprenvl (30 μM) pou 24 h, ak Lè sa a, incubated ak 1.5 mM MPP + pou 24 h. Apre sa, 10 μL nan Solisyon Selil Kit-8 te ajoute nan chak byen ak enkyete pou 1 h. Absòbe a te mezire a 450 nm [60].

4.4. Antretyen Pwason

Apwobasyon etik pou itilizasyon bèt yo te akòde pa konsèvasyon bèt la epi sèvi ak komite sant bèt eksperimantal la, Zhejiang Inivèsite (ZJU2020125). Granmoun zèb (AB souch) yo te jwenn nan sant laboratwa bèt nan Inivèsite Zhejiang (Hang Zhou, Lachin) ak konsève nan 28±1 ° Cunder 14h limyè / 10h sik nwa. Pwason yo te manje Artemia nauplii de fwa chak jou [61]. Pou pwodwi anbriyon, granmotan yo te mete nan tank elvaj lannwit lan nan yon 1:1 gason: rapò fi. Yo te deklannche èspasyal apre limyè yo te vire sou pwochen maten an epi yo te fini nan 2 h. Anbriyon yo te leve soti vivan nan dlo anbriyon (13.7 mM NaCl,540 μM KCL,25 UM NahPOA44 uM KHPOA, 300 uM CaCl2, 100 μM MgSO, 420 μM NaHCO3, pH 7.4) nan 28 °C【62,63】.

4.5. ROS mezi

Pou mezire pwodiksyon ROS, selil PC12 (2×104 selil / byen) yo te ekspoze a 1,2 oswa 4 μg / mL nan PC oswa deprenyl (30 μM) pou 24 h ak Lè sa a, incubated ak 1.5 mM MPPt pou 24 h 【64 】. Selil yo te ekspoze a 10 μM 2', 7'-Dichlorofluorescin solisyon dyacetate nan kondisyon nwa pou 30 min; solisyon an te Lè sa a, retire, ak selil yo te lave ak saline fosfat-afekte (PBS)3 fwa. Imaj yo nan selil yo te obsève lè l sèvi avèk yon Olympus lazè optik konfo mikwoskòp (Olympus, Tokyo kapital, Japon). Entansite fliyoresans nan selil yo te quantified lè l sèvi avèk Imaj J lojisyèl v1.8.0 (Olympus, Tokyo kapital, Japon). Rezilta yo eksprime kòm yon pousantaj nan zòn nan nan rejyon ROS nan gwoup la kontwòl.

Pou mezire pwodiksyon ROS, lav la zebrafish nan 3 jou post fètilizasyon (dpf) yo te ekspoze a deprenyl (40 μM) oswa 4,8 oswa 16 ug / mL nan PCs avèk oswa san 400 μM MPTP pou 4 jou. Zebrafish lavabo nan 7 dpf yo te transfere nan yon plak 24-byen (10 lavabo pou chak gwoup), trete ak 20 μM 2',7'-Dichlorofluorescin solisyon dyacetate, ak incubated pou 60 min nan fènwa a nan 28.5 °C [65]. Lè sa a, lavabo te lave twa fwa ak mwayen anbriyon yo retire depase 2',7'7-Dichlorofluorescin dyacet. Imaj yo nan lav yo tache yo te obsève lè l sèvi avèk yon olenpis lazè olenpik konfo mikwoskòp. Entansite a fluoresans nan lav endividyèl la te quantified lè l sèvi avèk Imaj J lojisyèl. Rezilta yo eksprime kòm yon pousantaj nan zòn nan nan rejyon ROS nan gwoup la kontwòl. 4.6.Evalyasyon nan MDA, GSH-Px, SOD, ak CAT

Selil PC12 yo (2×104 selil / byen) yo te ekspoze a 1,2 oswa 4ug / mL nan PC oswa deprenyl (30 μM) pou 24h, ak Lè sa a, incubated ak 1.5 mM MPP + pou 24h. Lè sa a, 1 mL nan ekstrè te ajoute nan 4× 10° selil yo, ak selil yo te kase pa santrifujeur ultrason nan 8000 rpm nan 4 ° C pou 10 min. Supernatant la te Lè sa a, mete yon fwa pou tès, ak reyaksyon yo te ajoute pou detèminasyon an nan MDA, GSH-Px, SOD, ak CAT, respektivman. Chak endèks te repete nan triplicate.

Lavabo zèb la nan 3dpf yo te incubated ak deprenyl (40 μM)oswa4,8 oswa 16 μg / mL nan PC yo avèk oswa san 400 μM MPTP pou 4 jou. Lè sa a,0.05 g nan zèv lavabo ak 0.5 mL nan ekstrè yo te omojèn nan yon beny glas ak Lè sa a, santrifujeur nan 4 °C pou 10 min. Yo te mete sipènatan an yon fwa pou fè tès. Reyaksyon yo te imedyatman te ajoute pou detèminasyon an nan MDA, GSH-Px, SOD, ak CAT, respektivman. Chak endèks te repete nan triplicate.

4.7. Preparasyon nan tout selil, Cytoplasmic, ak Pwoteyin nikleyè

Pou ekstraksyon pwoteyin antye-selil, selil yo te ranmase ak incubated ak RIPA lysis tanpon ki gen 1% PMSF ak 1% pwoteyin anpeche bwason inibitè pou 30 min yon fwa. Selil yo te santrifye, ak sipènatan an te ranmase epi yo te estoke. Pou preparasyon fraksyon subcellar, echantiyon selil yo te trete lè l sèvi avèk twous nikleyè ak cytoplasmic pwoteyin ekstraksyon. Kontni pwoteyin la te atake lè l sèvi avèk BCA la (Beyotime, Shanghai, Lachin) atake.

4.8. Nrf2 Transfeksyon SiRNA

Nrf2-siRNA te itilize pou frape Nrf2. PC12 selil yo te transfere ak NrF2-siRNA (80 nM) oswa kontwòl siRNA lè l sèvi avèk Lipofectamine 2000, selon manyèl la. 4.9.Western Blotting

Echantiyon pwoteyin yo te rezoud pa SDS-PAGE ak transfere nan polyvinylidene di-fluoride (PVDF) manbràn. Blòt yo te ekspoze a antikò prensipal ki apwopriye: Nrf2, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, GAPDH ak peroksid-konjige antikò segondè. Gwoup pwoteyin yo te visualized lè l sèvi avèk ECL (Beyotime, Shanghai, Lachin) plis reyaksyon deteksyon lwès [36,43].

4.10.Locomotor Tès konpòtman

Lavabo zèb la nan 3dpf yo te incubated ak deprenyl (40 μM)oswa4,8or16 ug / mL nan PC yo avèk oswa san 400uM MPTP pou 4 jou. 7 dfp zèb yo te mete nan 24-byen plak (1 pwason pou chak byen ak 12 lav pou chak gwoup), ak distans total chak pwason sou 10 min te anrejistre. Konpòtman Zebrafish te kontwole ak analize lè l sèvi avèk yon sistèm swiv videyo otomatik (Nenpòt-maze 4.73, Stoelting, Wood Dale, IL, USA)[66].

4.11.Total RNA Ekstraksyon, Transkripsyon ranvèse, ak Quantitative Reyaksyon An tan reyèl

RNA te ekstrè lè l sèvi avèk RNAiso Plus apre enstriksyon manifakti a. RNA te ranvèse transkri lè l sèvi avèk yon PrimeScriptTMRT Kit ak GDNA Eraser, apre enstriksyon manifakti a. Analiz Quantitative an tan PCR te fèt sou yon Biosystem aplike ViATM 7 sistèm an tan reyèl PCR lè l sèvi avèk SYBRPremix Ex taqTM II (Takara, Shiga, Japon).β-actin te itilize kòm yon jenetik referans ak ekspresyon jenetik relatif te kalkile lè l sèvi avèk 2-△Ct metòd la. Sekans prensipal yo itilize nan rechèch la ki nan lis nan Tablo 1.

4.12. Zebrafish Antiterosine Hydroxylase (TH)Tout-Mount Immunostaining

Lavabo Zebrafish nan 1 dp te incubated ak deprenyl (40 μM) oswa 4,8 oswa 16 ug / mL nan PCs avèk oswa san 400 UM MPTP pou 2 jou (10 pwason / gwoup pakèt). Larvae te fiks ak 4% paraformaldehyde nan PBS pou 30 min. Apre yo fin fiksasyon, yo te trete yo pou tout-mòn iminitè nan TH [67]. Nan tanperati chanm, 2%(v/ o) lamb serum and 0.1%(w/ø)bovine serum albumin (BSA)yo te bloke nan fosfat-buffered saline Tween-20 (PBST) pou 1 h. Lè sa a, yo te ekspoze nan bloke tanpon antitiwozinantikò idwoksiklas (1:200 dilye, Proteintech) pou 2 h, ak Lè sa a, rense 6 fwa ak PBST. Dènye etap iminitè a te fèt nan tach tanpon ak 488 kabrit antirab (1:500) pou 1 h ak lave ankò ak PBST. Apre devlopman koulè ase, zèb la te plat-monte ak 3.5%methylcelluloseak imaj lè l sèvi avèk yon Olympus lazè optik konfo mikwoskòp.

4.13. Analiz estatistik

Yon fason analiz de divèjans (ANOVA) ki te swiv pa tès konparezon miltip Tukey a te itilize pou konpare mwayen diferan gwoup. Graphpad Prism v6.01 (GraphPad Lojisyèl, San Diego, CA, USA) te itilize pou analiz estatistik ak trase graf yo.

5. Konklizyon

An konklizyon, rezilta nou yo endike ke PCs egzèse efè nerotektiv atravè aktivasyon nan chemen Nrf2 / YO AK enstriksyon li yoezentoksikasyonEmedyatè nzim. Ansanm, Sur sa yo sijere ke PC yo ka itil pou trete PD.

Atik sa a ekstrè soti nan Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules