Etid sou fonksyon iminitè neroendokrin Cistanche Deserticola ak pwodwi vapeur diven diri li yo nan modèl rat glucocorticoid-Ⅰ

1. Entwodiksyon

Cistanche deserticola, ki rele "ginseng dezè," se yon medikaman tradisyonèl Chinwa ki te itilize pandan plizyè syèk kòm yon zèb yang-tonik poudinamize ren an ak ranfòse yang la[1]. Uit espès ak yon varyasyon nanCistanche Herba yo te anrejistre nan Lachin ak sèlmanCistanche deserticolaYC Ma akCistanche tubulosa(Schenk) Wight yo anrejistre nan Farmakope Chinwa [2]. Etid farmakolojik te demontre saCistanches Herbamontre neuroprotective [3], imunomodulateur [4], kardyoprotective [5], antifatig [6], anti-enflamatwa [7], epatoprotective [8], antioksidatif [9], anti-bakteri [10], laksatif [11], ak antitumoral. efè [12]. Gwo spectre aktivite byolojik rapòte nan genus sa a te atribiye nan konpozisyon fitochimik konplèks ak varye li yo.Cistanche deserticolagen glikozid phenylethanoid, iridoid, polisakarid [13], elatriye Kontni an nan glikozid phenylethanoid se pi wo a nan materyèl medsin orijinal yo [14].

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU ANVIGORE PHGS REN 75% ECH 30% ACT 12%

Pwosesis Chinwa Materia Medica (CMM) se yon teknik tradisyonèl pharmaceutique pou satisfè diferan kondisyon pou trete, dispense, ak fè preparasyon dapre teyori medikaman tradisyonèl Chinwa. Pwodwi sa yo trete yo rele moso dekoksyon, ki itilize nan klinik yo. Pwosesis gen pou objaktif pou amelyore efikasite nan diminye toksisite nan dwòg brit. 2015 Chinwa Pharmacopeia anrejistre ke Cistanche epè tranch (CD) ak diri diven-vapè Cistanche (WCD) ta ka itilize kòm moso dekoksyon nan klinik la. Gwoup rechèch nou an te montre ke efè laksatif la te soulaje, epi efè dinamize antiaging ak ren-yang te ogmante apre Cistanche te vapè ak diven diri [15].

Fonksyon aks hypothalamus-pitwitèr-adrenal glann-thymus glann (HPAT) dezòdone nan sendwòm defisyans nan ren-yang [16]. Pasyan ki gen defisi nan ren-yang tou gen gwo malfonksyònman iminitè. Malfonksyònman aks HPA se pre relasyon ak iminodefisyans. Teyori rezo neuroendokrin-iminitè (NEI) montre ke sistèm iminitè ak neroendokrin yo pataje anpil ligand ak reseptè [17], epi ipotalamus la konsidere kòm pivot pou lyen neuroendocrin lan ak sistèm iminitè yo.

Nan etid sa a, nou repwodui defisi nan ren-yang nan rat modèl ak piki kortikoterapi ekzojèn ak eksplore mekanis nan deficiency nan ren-yang an repons a diferan pwodwi trete nan Cistanche deserticola nan pèspektiv nan fonksyon andokrin-iminitè.

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Materyèl ak reyaktif

Cistanche deserticola te ranmase nan men Alashan Neimenggu nan 2019.5 epi idantifye kòm tij chèch chèch nan Cistanche deserticola YC Ma pa Pwofesè Yanjun Zhai (Lekòl nan famasi, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Lachin). Espesimèn bon yo te konsève nan Liaoning Processing Jeni Teknoloji Sant.

Konpoze estanda nan ajugol yo te achte nan men Chengdu Pure Chem-Standard Co, Ltd (Chengdu, Lachin); cistanozid F,echinacoside, cistanoside A, ak isoacteosideyo te achte nan men Must Company (Sichuan Lachin); acteoside te achte nan men Dalian Meilun Bio. Co, Ltd (Dalian, Lachin). MS-klas asetonitrile ak metanol yo te achte nan men Merck KGaA (Darmstadt, Almay). HPLC-klas asid fòmik te achte nan Merck KGaA (Darmstadt, Almay). Diven diri te achte nan men Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co, Ltd (Zhejiang, Lachin).

Kortikosteron (CAS: 50-22-6, pite > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewan grenn (Beijing Tongrentang Teknoloji Devlopman co, Ltd.), rat ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2, ak IL-10 ELISA deteksyon twous yo te achte nan men Nanjing Jiancheng Co., Ltd. BOSK Co. te founi twous ELISA kortisol rat la, rat CD4 antikò, CD8a antikò (nèb 561833 ak 559976), RBC lysate (Solarbio, R1010), solisyon tanpon PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM, ak -aktin en ak en primary. yo te bay Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transcription Twous (no RR037A) ak cDNA Synthesis Kit (pa gen okenn 10000068167) te bay pa Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Chloroform, isopropanol, 75% etanòl, ak uretan solisyon yo te tout analyse pi bon kalite ak pwodwi pa Sinopharm Chimik Reagent Co, Ltd Ultrapure dlo te pwodwi pa sistèm nan Milli-Q (18.2 MΩ, Millipore, MA, USA).

2.2. Enstriman eksperimantal

Yon makè anzim (Thermo, modèl 3530911931), machin pou lave plak otomatik (modèl HBS- 4009), ekspozisyon dijital pouse-rale fòs mèt (modèl VICTOR- 50N), santrifujeur konjelasyon gwo vitès (modèl Sigma 3k15). ), ultramicro spectrophotometer (modèl B-50Q), anplifikatè jèn (modèl L96G), fluoresans an tan reyèl PCR quantitative (modèl StepOne), sitomèt koule (modèl AC66051710132), mikrotom parafine (modèl Laika), mikwoskòp (Olympus). , modèl BS-53), ak yon enstriman dlo pi (modèl F7JA36507) yo te itilize.

2.3. Preparasyon echantiyon pou UPLC-Q-TOF-MS ak Eksperyans Farmakolojik

WCD te trete nan menm pakèt laCistanche deserticolanan laboratwa nou an. Pou preparasyon WCD, moso CD sèk (5 mm epesè) (100 g) yo te enfuze ak diven diri (30 mL), vapè nan presyon ki wo (1.25 kPa) pou 4 èdtan, ak Lè sa a, seche nan 55 degre.

Poud yo koryas nan CD ak WCD yo te tranpe nan 1 0 fwa 95% etanòl pou 0.5 èdtan, rflu-extrait 3 fwa chak fwa pou 1 èdtan, epi yo te filtre, ak filtrates yo 3 fwa yo te konbine. Etanòl la te refè anba presyon redwi, epi yo te jwenn ekstrè a pou administrasyon an. Ekstrè a (1 mL) te ajoute nan 50% metanol, pote volim total nan 20 mL, epi estoke nan 4 degre pou analiz kontni.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMÉLIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS Kondisyon pou analiz CD ak WCD Ekstrè

2.4.1. LCThMS Kondisyon Analitik

Yo te itilize sistèm UPLC-MSThMS ak lojisyèl MassLynx 4.1 Analis pou fè akizisyon done ak pwosesis. Kolòn analyse a se te yon Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}{0 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) nan yon tanperati 40 degre C. Faz mobil lan te 0.1% asid fòmik solisyon akeuz (A) ak asetonitrile ki gen 0.1% asid fòmik (B). Gradyan elisyon an te 0.00-1.00 min ak 3% B, 1.01-2.00 min ak 3%-11.5% B, 2.01-3.{{29 }} min ak 12% B, 3.01–4.00 min ak 15% B, 4.01–5.00 min ak 20% B, 5.01–6.00 min ak 22 % B, 6.01-8.00 min ak 25% B, ak 8.01-9.00 min ak 10% B. Pousantaj koule a te 0.3 mLTh min, ak volim piki a te 1.0 μL.

Waters triple quadruple mas spectrometer (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) ekipe ak yon sous electrospray ionizasyon (ESI) te itilize nan mòd negatif ion. Gaz desolvasyon an te nitwojèn ak yon pousantaj koule 500 LThh nan yon tanperati 250 degre. Tout konpoze detekte yo te mezire nan mòd siveyans reyaksyon miltip (MRM); Tablo 1 montre paramèt enèji yo, ak Tablo 2 montre koub kalibrasyon pou konpozan analize yo.

2.4.2. Preparasyon Sibstans Referans

Tubuloside A (3.02 mg), echinacoside (3.00 mg), 2′-acetylatteoside (2.34 mg), acteoside (2.45 mg), izoakteozid (0.61 mg), cistanoside F ( 2.14 mg), salidroside (3.39 mg), asid geniposidic (2.84 mg), ajugol (1.58 mg), ak catalpol (2.39 mg) yo te fonn nan metanol pou prepare yon solisyon stock. Solisyon stock la te dilye ak metanol pou jwenn konsantrasyon apwopriye pou solisyon estanda k ap travay yo. Tout solisyon prepare yo te estoke nan 4 degre anvan ou itilize.

2.5. Preparasyon ak gwoupman modèl bèt

SD gason rat (180-220 g) te achte nan Liaoning Changsheng Biotechnological Co, nimewo pèmi bèt: SCXK (Liao) 2015-0001. Tout rat yo te kenbe ak aksè gratis nan manje ak dlo nan 25 degre ak yon imidite relatif nan 30-50%. Bèt yo te loje pou 7 jou anvan eksperyans yo.

Yon santèn rat yo te owaza divize an 10 gwoup: gwoup kontwòl vid (BC), gwoup kontwòl modèl (MC), gwoup kontwòl pozitif (PC), gwoup kontwòl diven diri (WC), CD gwo dòz (CD). -HD), gwoup CD mwayen dòz (CD-MD), gwoup CD dòz ki ba (CD-LD), gwoup WCD gwo dòz (WCD-HD), gwoup WCD mwayen dòz (WCD-MD), ak Gwoup WCD ba-dòz (WCD-LD). Dòz CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD, ak CD-LDThWCD-LD te 5.48 gTh (kg ∙ d), 2.74 gTh (kg ∙ d), ak 1.37 gTh (kg ∙ d), respektivman. Dòz la pou gwoup PC a te 1.646 gTh (kg ∙ d), ak pou gwoup WC a, 1 mLTh100 g pou 40 jou. Sou 6yèm jou apre administrasyon an, yo te enjekte rat yo anba lar ak sispansyon dlo kortikosteron (corticosterone + 0.1% dimethyl sulfoxide + 0.1% Tween-80 + 0.9% klori sodyòm) eksepte pou gwoup BC [18]. Konsantrasyon nan kortikosteron te 5 gThL, ak dòz la te 0.1 mLTh100 g. Yo te bay rat yo nan gwoup BC a saline nòmal + 0.1% dimethyl sulfoxide + 0.1% Tween- 80 + 0.9% klori sodyòm pa piki nan menm dòz la.

2.6. Detèminasyon Fonksyon Aks HPA

2.6.1. Pwa, Tanperati, ak kenbe pouvwa tès

Yo te fè yon tès pwa chak 3 jou, epi yo te pran tanperati a chak 6 jou. pandan eksperyans lan. Nan 39yèm jou a, yo te mezire fòs maksimòm manm dèyè a pa yon mèt grip. Rat yo te mete sou platfòm lis, fè manm dèyè yo pwan poto a. Rat yo pral enstenktif pwan nenpòt objè pou anpeche deplase bak lè ke a rale jiskaske fòs rale a depase priz la. Lè rat la pèdi priz li, preamplifier a te kapab otomatikman anrejistre fòs maksimòm priz la.

2.6.2. Detèminasyon Nivo T, CRH, ACTH, CORT, ak Kortisol nan serom

Yon èdtan apre dènye administrasyon an, rat yo te anestezi pa piki intraperitoneal nan yon solisyon uretan (20 gTh100 mL). Lè sa a, echantiyon san yo te kolekte, santrifuje nan 3500 r pou 15 min pou jwenn serom la, epi estoke nan -20 degre. Konsantrasyon T, CRH, ACTH, CORT, ak kortisol yo te mezire ak twous ELISA rat dapre enstriksyon manifakti a.

2.6.3. Obsèvasyon mikwoskòp

Estrikti mòfolojik tisi glann adrenal yo te obsève pa tach HE. Tisi adrenal yo te fiks nan 10% paraformaldehyde, dezidrate nan etanòl, te fè transparan pa yon solisyon xylene, entegre pa metòd konvansyonèl, koupe nan 4 μm tranch epè, dewaxed ak solisyon xylene, idrate ak gradyan etanòl la, ak Lè sa a, tache ak ematoksilin ak eozin. solisyon tach. Apre yo fin fè transparan ak ksilèn, plak la te sele ak jansiv net epi obsève anba yon mikwoskòp.

2.6.4. Tach imunohistochimik nan Bax, Bcl-2, Caspase{-3, Fas, ak ekspresyon pwoteyin FasL nan glann adrenal la

Seksyon adrenal rat yo te fikse ak fòmalin, yo te deparafine ak reidrate apre yo te fin koupe nan yon epesè 4 μm. Pou bloke aktivite peroksidaz andojèn, seksyon yo te preenkube nan blòk oksijene idwojèn pou 1 0 min. Seksyon yo te tranpe nan 0.01 M sitrat (pH 6.0) epi yo te chofe a bouyi. Pwosesis la te repete apre 5-10 minit. Apre refwadisman, seksyon yo te lave ak PBS (pH 7.2-7.6) 1-2 fwa, kite nan tanperati chanm pou apeprè 5 min, epi lave ak PBS (pH 7.2-7.6) 2-3 fwa. Yo te ajoute solisyon an 5% BSA bloke nan tanperati chanm, ak likid ki depase sou seksyon an te souke 20 minit pita. Antikò prensipal dilye espesifik pou FasTh FasL, Bcl-2ThBax, ak caspase{-3 (1:100 dilye ak PBS) yo te ajoute epi enkube a 37 degre pou 1 èdtan oswa 4 degre lannwit lan. Seksyon yo te lave 2-3 fwa ak PBS (pH 7.2-7.6). Lè sa a, yo te ajoute biotinylate kabrit anti-sourit IgG, epi seksyon yo te cheche nan 20-37 degre pou 20 min epi lave ak PBS (pH 7.2-7.6) 4 fwa pou 5 min. Apre yo fin lave byen nan PBS, seksyon yo te enkube ak yon melanj de reyaktif A ak B pou 30 minit, enkubate ak PBS pou 45 minit, epi finalman devlope ak DAB substrate (DAKO) pou 30 minit anvan yo te yon ti kras kontre ak ematoksilin, dezidrate, epi monte.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMÉLIORE SANSATION SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Detèminasyon Fonksyon Iminitè

2.7.1. Kalkil Index ògàn iminitè

Yon èdtan apre dènye administrasyon an, rat yo te anestezi pa piki intraperitoneal nan solisyon urethane (20 gTh100 mL), ak Lè sa a, larat la ak timis yo te retire epi yo te peze imedyatman nan yon kapo esteril. Koefisyan pwa larat oswa timis la (%) � pwa larat oswa timus (mg) Pwa kò (g).

2.7.2. Deteksyon T Lymphocyte Soussets nan san periferik

Splenosit ak emosit yo te enkube ak antikò monoklonal anti-CD4 (PE) ak anti-CD8 (FITC) pou 30 minit nan fè nwa a. Yo te ajoute 2 mL nan lisat eritrosit, epi yo te melanje solisyon an pa vortexing. Yo te kite solisyon an nan fènwa pou 10 minit epi santrifuje pou 5 minit. Yo te jete sipènatan an, epi apre sa yo te lave solisyon an 3 fwa ak PBS glas frèt epi li te resuspend nan solisyon pèmeabilize PBS. Omwen 10,000 selil yo te analize pa sikometri koule nan 1 èdtan apre chak tach Mab.

2.7.3. Detèminasyon nivo IL-10, IL-6, IL-2, TNF-, ak IFN-c nan serom

Yon èdtan apre dènye administrasyon an, rat yo te anestezi pa piki intraperitoneal nan solisyon urethane (20 gTh100 mL), epi yo te pran san nan aorta nan vant. Yo te santrifuje san an nan 3500 r pou 15 minit pou jwenn serom la epi estoke nan -20 degre. Konsantrasyon IL-10, IL-6, IL-2, TNF-, ak IFN-c yo te detekte ak twous ELISA rat dapre enstriksyon manifakti a.

2.8. Ekspresyon nan CaM nan ipotalamus ak tisi ipofiz

Total RNA te extrait de hypothalamus ak hypophysis tissus pa TRIzol. Transkripsyon ranvèse te pote soti sou 10 μL nan RNA total selon enstriksyon manifakti a. Kantite egal cDNA yo te analize atravè qPCR nan prezans lank dsDNA-obligatwa (Promega, USA) ak CFX 96 Real-time PCR System (Bio-Rad, USA) pou gade diferan jèn yo nan kondisyon premye deklanchman nan. 95 degre pou 10 min, 40 sik denaturasyon nan 95 degre pou 15 s, ak ekstansyon annealing nan 60 degre pou 1 min.

Jadendanfan pou CaM ak -aktin yo bay nan Tablo 1, epi yo te itilize -aktin kòm yon kontwòl entèn. Chak echantiyon te nòmalize lè l sèvi avèk diferans lan nan papòt kritik (Ct) ant jèn nan sib ak -aktin. Yo te itilize ekwasyon sa a pou dekri rezilta a: ΔΔCt � (Ct sib jèn − Ct -aktin jèn) gwoup eksperimantal − (Ct sib jèn − Ct -aktin jèn) gwoup kontwòl. Lè sa a, nivo mRNA chak echantiyon yo te konpare, lè l sèvi avèk ekspresyon 2- ΔΔCt jèn sib la. Yo te fè mwayèn rezilta chak gwoup (Tablo 3).

2.9. Analiz estatistik

Tout done yo te analize avèk lojisyèl SPSS (vèsyon 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Diferans ant gwoup yo te analize ak yon sèl-fason repete-mezi analiz de divèjans (ANOVA). Rezilta yo te eksprime kòm mwayen ± devyasyon estanda (SD) lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism (vèsyon 6.0, San Diego, CA, USA). Diferans ak yon valè P mwens pase 0.05 yo te konsidere estatistik enpòtan.

3. Rezilta eksperimantal

3.1. UPLC-QqQ-MSAnaliz

Pou reyalize pi bon separasyon, fòm pik, ak yon tan analiz kout, kondisyon kwomatografik yo ki gen ladan kolòn, faz mobil, ak pwogram gradyan yo te etidye nan eksperyans preliminè nou an. Kwomatogram tipik ak mòd MRM yo prezante nan Figi 1.

Soti nan tablo 4, nou ka wè ke sa ki nan glikozid phenylethanoid nan WCD te ogmante konpare ak sa yo ki nan CD, espesyalman pou echinacoside ak acteoside, pandan y ap kontni an nan iridoid te diminye nan WCD.

3.2. Règleman pou Fonksyon Aks HPA

3.2.1. Pwa, Tanperati, ak kenbe pouvwa tès

Rat yo nan gwoup la MC ak gwoup eksperimantal yo te montre sentòm defisyans ren-yang piti piti apre yo te bay kortikosteron. Sentòm yo, tankou pèdi pwa, ipotèmi, pèt ekla cheve, espri tonbe, lag nan repons, ak yon diminisyon enpòtan nan konsomasyon dlo ak aktivite, amelyore anpil nan gwoup CD ak WCD. Figi 2(a) montre chanjman pwa yo. Pwa chak nan gwoup dwòg yo te ogmante, espesyalman nan gwoup CDHD ak WCD-HD. Pran pwa nan gwoup MC a te pi ba a. Figi 2 (b) montre chanjman tanperati yo, ki te pi ba nan gwoup MC a, ak tanperati a ogmante nan gwoup WCD-HD, WCD-MD, ak WCD-LD.

Figi 2 (c) montre ke pouvwa kenbe ogmante pou gwoup BC a ak chak gwoup eksperimantal yo, ak gwoup WCD-MD la te pi wo a, ki te demontre ke siy feblès pwovoke pa defisi nan ren-yang amelyore apre administrasyon an.

3.2.2. Nivo T, CRH, ACTH, CORT, ak Kortisol

Figi 3 montre ke konpare ak gwoup BC a, nivo T, CRH, ACTH, ak CORT nan serom rat la diminye (P <0.01) ak nivo kortisol diminye (P). < 0.05) nan gwoup MC. Konpare ak gwoup MC a, nivo T nan gwoup WCD-HD ak WCD-MD ogmante (P <0.01), nivo CRH nan WCD-LD la, WCD-MD, ak gwoup WC yo amelyore (P <0.01), kontni ACTH ogmante nan gwoup CD-HD, WCD-MD, ak WCD-HD (P <0.01), nivo CORT amelyore nan gwoup la. Gwoup CD-MD, WCD-MD, ak WCD-HD (P <0.01) ak amelyore nan gwoup CDHD ak WCD-LD (P <0.05), ak nivo kortisol ogmante nan chak gwoup dwòg.

3.2.3. Rezilta Obsèvasyon mikwoskòp

Tisi glann adrenal yo ka divize an kouch kortik la ak kouch medul la. Kouch kortik yo gen ladan kouch globilè, pake, ak retikul. Selil yo gen plis lipid, ak kouch medul la konsiste de selil feochromocytoma ak yon ti kantite tisi fib. Jan yo montre nan Figi 4, nou te jwenn ke tout bagay te nòmal nan gwoup la BC, pandan y ap nan gwoup la MC, cortical adrenal la te evidan hyperplasia, atrofi selilè, ak ogmante dansite. Bann anpoul la te epè, ak zòn faskilè translusid la, zòn retikularis etwat, ak selil ki pi piti yo te montre koloran inegal ak konjesyon kapilè. Nan gwoup PC a, limit kortik ak medulè yo te vizib. Selil yo nan bann globilè ak pake yo te ranje respire, e estrikti mòfolojik la te retabli. Menm pi bon restorasyon an te obsève nan gwoup WCD yo, ak efè yo nan gwoup WCD-MD yo te pi bon pase sa yo ki nan gwoup WCD-HD ak WCD-LD. Mòfoloji glann adrenal la nan gwoup CD yo pa t osi bon ke sa nan gwoup WCD yo.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMÉLIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%