Sible Cathepsin B pa Cycloastragenol Amelyore iminite antitumoral nan selil T CD8 atravè anpeche Degradasyon MHC-I Pati 1

REZIME

Jan nou koumansePèt antijèn timè yo ak rediksyon selil CD8 T ki te koze pa chemen PD-1/PD-L1 yo se faktè enpòtan pou chape iminitè timè yo. Nan dènye ane yo, te gen plis rechèch sou medikaman tradisyonèl Chinwa nan tretman timè. Cycloastragenol (CAG), yon efektif molekil aktif nan Astragalus membranaceus, yo te jwenn ki gen antiviral, antiaging, anti-enflamatwa, ak lòt fonksyon. Sepandan, efè antitumoral ak mekanis li yo pa klè.

Glycoside nan cistanche ka ogmante tou aktivite SOD nan kè ak tisi fwa, ak siyifikativman redwi kontni an nan lipofuscin ak MDA nan chak tisi, efektivman scavenging divès kalite radikal oksijèn reyaktif (OH-, H₂O₂, elatriye) ak pwoteje kont domaj ADN ki te koze. pa OH-radikal. Cistanche phenylethanoid glikozid gen yon gwo kapasite scavenging nan radikal gratis, yon pi wo kapasite diminye pase vitamin C, amelyore aktivite a nan SOD nan sispansyon espèm, redwi kontni an nan MDA, epi yo gen yon sèten efè pwoteksyon sou fonksyon manbràn espèm. Cistanche polisakarid ka amelyore aktivite SOD ak GSH-Px nan eritrosit ak tisi nan poumon nan sourit senesan eksperimantal ki te koze pa D-galaktoz, osi byen ke diminye kontni an nan MDA ak kolagen an nan poumon ak plasma, ak ogmante kontni an nan elastin, gen yon bon efè scavenging sou DPPH, pwolonje tan an nan ipoksi nan sourit senesan, amelyore aktivite a nan SOD nan serom, ak retade koripsyon fizyolojik nan poumon nan sourit senesan eksperimantal Avèk koripsyon selilè mòfolojik, eksperyans yo te montre ke Cistanche gen bon kapasite antioksidan. epi li gen potansyèl pou yo dwe yon dwòg pou anpeche ak trete maladi po aje. An menm tan an, echinacoside nan Cistanche gen yon kapasite enpòtan pou elimine radikal gratis DPPH epi li gen kapasite pou elimine espès oksijèn reyaktif epi anpeche degradasyon kolagen an radikal gratis, epi tou li gen yon efè reparasyon bon sou domaj anyon radikal gratis timin.

Klike sou avantaj ak dezavantaj cistanche

【Pou plis enfòmasyon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

MetòdYo te envestige efè antitumoral CAG nan modèl timè MC38 ak CT26 sourit transplantasyon. Efè antitumoral CAG te analize plis atravè sekans milti-omik sèlil. Teknoloji pwofil aksè ki reponn ak objektif yo te itilize pou jwenn pwoteyin sib CAG. Imedyatman, yo te eksplore mekanis antitumoral CAG lè l sèvi avèk mikwoskospi konfokal, imunopresipitasyon, ak transfè plasmid mutan. Finalman, yo te envestige efè konbine antitumoral CAG ak PD-1 nan sourit oswa organoid.

Rezilta yoNou te jwenn ke CAG efektivman anpeche kwasans timè nan vivo. Atlas milti-omik yon sèl selil nou an te demontre ke CAG te ankouraje prezantasyon antijèn timè-sifas selilè yo e li te karakterize pa fonksyon améliorée touye CD8 plis selil T yo. Mechanisticman, CAG mare nan sib pwoteyin kathepsin B li yo, ki Lè sa a, inibit degradasyon an lizozomal nan gwo konplèks istokonpatibilite I (MHC-I) ak ankouraje n total MHC-I nan manbràn selilè a, ranfòse pre-estasyon an nan antijèn timè a. . Pandan se tan, konbinezon an nan CAG ak PD-1 antikò efektivman amelyore timè a touye timè-tiye CD8 plis selil T nan sourit xenograft ak organoid kansè kolorektal. Konklizyon done nou yo rapòte la pou premye fwa ke cathepsin B downregulation konfere iminite antitumoral ak eksp dat mekanis nan antitumoral nan natirèl pwodwi CAG la.

ENTWODIKSYON

Kansè kolorektal se youn nan kansè ki pi komen atravè lemond. To ensidans li yo ak to mòtalite yo klase pami twa pi gwo yo, ki menase seryezman lavi ak sante moun.1 Metòd tretman komen yo enkli chimyoterapi operasyon ak radyoterapi, dwòg vize, ak imunoterapi.2–4 Sepandan, selil kansè yo anjeneral montre pèt antijèn sifas yo epi eksprime. nivo segondè nan molekil anpeche yo chape anba siveyans selil iminitè yo. Se poutèt sa, pou rezoud pwoblèm nan timè iminitè chape, chèchè yo te devlope inibitè pòs iminitè yo ak terapi neoantigen pou bloke maskin selil kansè yo nan selil iminitè. selil yo pa te amelyore anpil. Se poutèt sa, li patikilyèman enpòtan pou jwenn dwòg ki ka ankouraje e prezantasyon antijèn sifas timè Rekonesans selil kansè yo pa cytotoxik CD8 plis selil T depann sou chemen TCR/CD3/major histocompatibility complex (MHC-I). TCR resevwa antijèn ki prezan nan selil dendritik / selil kansè pwoteyin manbràn CI a epi li transmèt siyal la pou konekte CD3 byen sere, ki answit pwolonje pi fon nan sitoplasm la.9 10 An menm tan, ak aktivasyon siyal CD28/B7. , CD8 plis selil T yo ka koaktive pou rekonèt ak touye selil kansè yo.11 Etid resan yo te jwenn ke, nan pwosesis la nan pwogresyon timè, lizozom rezilta nan rediksyon nan MHC-I agrégation sou sifas la nan selil kansè yo, ki pa efektivman. prezante antijèn yo.12 13 Liu et al rapòte ke anpèchman PCSK9 ka anpeche degradasyon MHC-I nan lizozòm epi pèmèt MHC-I retounen nan manbràn selilè a pou prezante antijèn yo.12 Se poutèt sa, retabli fonksyon prezantasyon antijèn yo. nan MHC-I se patikilyèman enpòtan pou bloke timè chape iminitè.

Yon kantite etid yo te jwenn ke aplikasyon an nan molekil aktif nan medikaman tradisyonèl Chinwa n entèvansyon antitumoral gen gwo kandida.14 15 Cycloastragenol (CAG) se yon molekil aktif efikas nan Astragalus membranaceus, ki gen antiviral, anti-bakteri, anti- enflamatwa, ak lòt efè famasi, men efè antitumor li yo raman rapòte.16-19 Nan etid sa a, nou te jwenn ke CAG inibit kwasans lan nan timè trans ant nan timè kansè nan kolon Mekanis la sitou enplike nan anpeche degradasyon nan MHC-I, medyatè pa cathepsin B (CTSB), fè pwomosyon prezantasyon antijèn nan selil kansè yo, ak Lè sa a, amelyore kapasite nan touye CD8 plis selil T.

MATERYÈL AK METÒD

Antikò ak reyaktif

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 pousan). Antikò CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929 ), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB{_1557426 ), Aktin (Cat#{{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959), Tubulin (Cat#10094-1-AP, PRID: AB{_2210695), ak Twous Deteksyon Imunohistochimi Anti-sourit/lapen (Cat#PK10006) yo te achte nan men Proteintech. Antikò H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB{_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), ak CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB{_10842446) yo te achte nan men Santa Cruz Biotechnology. Antikò Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB{_2620142) te achte nan men Cell Signaling Technology. Antikò Na/K ATPase (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) te achte nan men Abcam. Antikò sitometri flux CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB{_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB{_2833003) ak CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802) yo te achte nan men BD Bioscience. Antikò sitometri koule nan Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575) te achte nan men BioLegend. Antikò sikometri NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB{_469664) ak IFN- -PE (Cat#{12-7311-81, RRID :AB_466192) yo te achte nan men Thermo Fisher Scientific. Yo te achte mwayen DMEM (Cat#01-052-1ACS), Penicilin Streptomycin (Cat#15140122), ak Fetal Bovine Serum (Cat#C04001-500) nan men Endistri Byolojik. Sewòm kabrit (Cat#88RNG001) ak Twous tès pwoteyin Pierce BCA (Cat#23225) te achte nan men Thermo Fisher Scientific. Antikò anti-moun PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB{_1095031 8) ak anti-sourit PD{-1 (Cat#BE0146, RRID: AB{_1094905 3) yo te achte nan men selil Bio X. Yo te achte Twous Disosyasyon Tisi timè MACS (Cat#130-095-929) nan Miltenyi Biotec.

Kilti selilè

Yo te kenbe liy selil kansè kolon sourit MC38 ak CT26 nan laboratwa nou an.20 Liy kansè nan kolon imen HCT-116 yo te jwenn nan Koleksyon Kilti Kalite Akademi Syans Chinwa a (Shanghai, Lachin). Selil MC38, CT26, ak HCT-116 yo te kiltive nan yon mwayen DMEM ki gen 10 pousan serom fetis bovin ak 1 pousan penisilin/streptomycin a 37 degre nan yon enkibatè 5 pousan CO2.

Eksperyans timè transplantasyon

Sourit C57BL/6JGpt fi sis-uit semèn, sourit BALB/c, ak sourit BALB/,c toutouni te achte nan men GemPharmatech (Nanjing, Lachin). Selil kansè MC38 oswa CT26 (1 × 106) yo te vaksinen anba lar nan chak sourit. Sou timè a grandi a 100 mm3, mikwofòn la te owaza divize an gwoup saline tampon fosfat (PBS) (egzanp, yon fwa pa jou) ak gwoup la CAG (egzanp, 50mg / kg yon fwa pa jou). Volim timè yo te detèmine pa mezi kalib lè l sèvi avèk fòmil V=longè × lajè2 /2. Lè volim timè sourit gwoup PBS yo te rive nan 1000 mm3, yo te pran timè sourit yo, yo te pran foto yo epi yo te peze yo.

Disosyasyon yon sèl selil soti nan sourit la pou yon sèl selil RNA/ATACseq

Timè solid ki soti nan sourit yo te dijere lè l sèvi avèk Twous Disosyasyon timè pou jwenn yon sèl selil sèl. Single celSingle-cell s ak yon konsantrasyon nan 1000 selil / 1000 selil chaje sou 10 × jenomik chromium kontwolè sèl selil sèl selil yo swiv pwotokòl manifakti a 10 × jenomik. Reyaktif transcription ranvèse, pèl jèl barcoded, ak lwil oliv patisyon yo te melanje ak selil yo pou gen jenere pèl jèl nan emulsyon (GEM) pou transcription ranvèse. scRNA-seq done preprocessing ak qua y kontwòl.

Dapre jenom referans sourit GRCm38 (mm10), CellRanger V.4.0.0 tiyo (10×Genomics) pou trete RNA yon sèl selil. done sekans pou chak eksperyans (GSE197229). Matris ekspresyon jèn dijital yo te zed nan R (V.4.0.4) lè l sèvi avèk pake Seurat (V.4.0.0).21 Anvan analiz dBeforem, selil yo te filtre pa nimewo UMI (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

SeaTac-seq done preprocessing ak kontwòl kalite

Selil selil ATAC-seq done (GSE197229) yo te pretrete pa selil Ranger-at (V.2.0.0) ak liy lòd konte a. Pou pwosesis ak analiz done scATAC-seq ki vin apre a, nou te itilize pake ArchR (V.1.0.1) la.24 Apre sa, nou te itilize fonksyon addArchRGethe nome ('mm10') pou anotasyon genòm epi kreye yon dosye flèch ak fonksyon cre ArrowFiles ak paramèt default yo. Apre sa, nou te itilize fonksyon filterDoublets pou efase doubt potansyèl yo epi nou te kreye yon pwojè ArchR lè l sèvi avèk fonksyon ArchRPoject ak paramèt default. Lè sa a, nou te itilize pake Harmony pou retire efè pakèt pa fonksyon addHarmony.25 Pou rediksyon dimansyon, nou itilize fonksyon addIterativeLSI nan ArchR pou kouri ak paramèt def yo. Pou entegre yon sèl selil, nou chwazi objè reducedDims ak amoni epi nou itilize fonksyon addTSNE ak paramèt 'perplexity=30' pou vizyalizasyon.

Analiz entegre done siRNA-seq ak scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Pou amelyore presizyon nan prediksyon yo pi byen entegre de done yo, nou yon lòt fwa ankò entegre done scATAC-seq ak scRNA-seq lè l sèvi avèk mòd 'entegrasyon kontrent' la. Yon ti tan, nou anote done scATAC-seq yo ak kalite selil ki baze sou nòt jèn yo nan scATAC-seq. Lè sa a, nou te kreye yon lis restriksyon konsa ke resanblans ekspresyon jèn yo te kalkile sèlman nan menm kalite selil pou tou de scATAC-seq ak scRNA-seq. Gwoupman san sipèvizyon ak t-SNE te revele 13 gwoup sub-selil, ki te anote pa makè li te ye oswa simitasyon nan Tablo 1 siplemantè sou entènèt.

Pseudotime filiaj trajectoire

Yo te dedwi trajectoire selil kansè selil kansè yo lè l sèvi avèk pake R Monocle2 (V.2.18.0).26 Monosit aprann graf prensipal eksplisit apati done jenomik yon sèl selil pa ranvèse Graph Embedding pou klase selil yo, kidonk rezoud konplèks. pwosesis byolojik yo djanm ak presizyon.27 Nou te itilize fonksyon ''differentialGeneTest'' pou dériver DEG nan chak grap, epi apre nou fin konstwi trajectoire selilè a, nou te detekte jèn yo eksprime diferans nan pseudo tan an. Tout jèn ki depann de pseudo-tan yo te vizyalize pa fonksyon trase_pseudotime_heatmap la pran yon objè CellDataSet. Yo te pwodwi trase trajèktwa liyaj ak koub ekspresyon lis ki baze sou CellDataSet pa trase_selil_trajè ak trase_jenn_nan_pseudotime, respektivman.28

Yon sèl selil kopi nimewo varyasyon rele

Pou idantifye selil malfezan ak varyasyon nimewo kopi kwomozòm gwo echèl klonal (CNV), nou te itilize pake inferCNV R pou dedwi pwofil jenetik chak selil ki baze sou ekspresyon mwayèn gwo seri jèn nan chak rejyon kwomozòm nan genòm timè a konpare ak selil nòmal yo.29 Sou yon baz echantiyon pa echantiyon, selil iminitè yo te itilize kòm yon referans pou estime CNV nan selil ki gen rapò ak kansè yo.

Analiz anrichisman

Yo te fè analiz KEGG ak annotasyon GO lè l sèvi avèk clusterProfiler pake R (V.3.11.1) ak paramèt PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10, ak MaxGSSize=500.20Gene set enrichment analysis (GSEA) te aplike lè l sèvi avèk 50 seri jèn karakteristik (h.all.V.7.4.symbols. gmt) pou idantifye siyifikativman anrichi. chemen fonksyonèl atravè lojisyèl GSEA (V.4.1.0), ak kritè tès depistaj nominal P-valè<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Kantite analiz PCR an tan reyèl

Selil MC38 ak HCT-116 yo te simen nan plak sis-pou pou 6 èdtan epi yo te trete ak CAG pou yon lòt 24 èdtan. Selil yo te lave twa fwa ak PBS frèt, epi santrifuje nan 18 0g pou 5min nan 4 degre. An menm tan an, apre fanm k'ap pile tisi timè a. Yo te retire RNA total nan MC38, selil HCT-116, ak tisi timè lè l sèvi avèk reyaktif TRIzol la, dapre enstriksyon manifakti a. Volim reyaksyon an te 20µL ki genyen: 1µg RNA, 5µL 5×Hiscript III qRT SuperMix, ak RNase Free dH2 O. Yo te sibi cDNA a PCR quantitative, ak yon volim reyaksyon 10µL ak 1µL cDNA, 5µL 5µL melanj qPCR, 0.75µM prims. (Anvan ak ranvèse), ak 3.25µL RNase-gratis dH2 O. GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Lachin) te sentetize primè yo dapre sekans sa yo (sou entènèt tablo siplemantè 2).

Dekouvèt sib atravè yon apwòch pwofil aksè ki reponn ak sib

Yo te fè tès depistaj pwoteyin ki lye CAG yo jan sa dekri anvan an.31 32 Yon ti tan, yo te itilize apwòch sib-reponsive accessibility profiles (TRAP) pou dekouvri pwoteyin lyezon CAG yo nan milye selil la lè yo siveye lizin angajman ligand pwovoke. chanjman aksè sou yon nivo pwoteòm. Yon ti tan, de asyèt selil yo te trete ak 10µM CAG ak dimethyl sulfoxide (DMSO), respektivman. Apre 1-èdtan enkubasyon, selil yo te pèmeabilize pa tanpon M-PER (Thermo Scientific) epi lisat ki te lakòz yo te make kovalan nan adisyon nan fòmaldeyid ak borane piridin konplèks ki ansanm espesyalman mete etikèt sou rezidi lizin pwoteyin nan tanperati chanm pou pwofil aksè. . Lè sa a, lysates yo te presipite pa sòlvan òganik, ak granules yo kolekte yo te redissolve nan 8mol / L ure, redwi pa dithiothreitol (DTT) nan 56 degre pou 30min, ki te swiv pa alkilasyon lè l sèvi avèk iodoacetamide (IAA) nan fè nwa pou 30min. Yon kantite apwopriye solisyon DTT te ajoute ankò pou reyaji ak depase IAA. Imedyatman, proteome a te dilye ak solisyon bikabonat amonyòm jiskaske konsantrasyon final la nan ure rive nan 1mol / L. Dijere pwoteyin yo kolekte yo te desaled sou kolòn C18 HLB (Waters, Milford, Massachusetts, USA), ak peptides yo anrichi yo te cheche ak rekonstitye nan 0.1 pousan asid fòmik (FA) solisyon akeuz. AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF sistèm (Waters) te anplwaye pou analize echantiyon yo genyen pou profil quantitative nan chanjman aksè lizin yo an repons a CAG obligatwa pou dekouvèt sib. Akizisyon depandans done nan mòd pozitif la te anplwaye pou done akizisyon. Analiz done yo te fèt lè l sèvi avèk PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Kanada). Espesyalman, cys alkylation te chwazi kòm yon modifikasyon fiks, ak oksidasyon methionine ak dimethylation lizin, reyalize pa etikèt TRAP, yo te mete kòm modifikasyon varyab. Yon ti tan, peptides ki gen dimethylation ki te pwovoke TRAP epi ki te montre siyifikatif chanjman abondans avèk ak san enkubasyon CAG yo te asiyen kòm peptides ki reponn sib. Pwopòsyon abondans chak peptide ki make TRAP endike limit chanjman aksesibilite epi li asosye intimman ak afinite ligand-obligatwa. Yo te fè tès t elèv la pou evalye si chanjman yo detekte aksesiblite nan peptides ki make yo se estatistik enpòtan. Yon valè p entègwoup (p<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Kilti Organoid

Chongqing Kingbiotech te konstwi ak kiltive òganoid kansè kolorektal imen yo.33 Yo te mens echantiyon tisi pasyan yo ak operasyon chirijikal la an ti moso pi piti ke posib pa sizo esteril. Yo te melanje moso tisi yo byen ak Matrigel (Corning, Cat#356231) nan rapò apwoksimatif 1:4 sou glas. Pwosesis ki vin apre a te refere a pwotokòl pibliye. Yon ti tan, sispansyon moso-Matrigel yo te simen byen vit nan plak multiwell la pou fòme ti gout emisferik epi yo transfere nan 37 degre pou 15-20min, sa ki pèmèt ti gout yo solidifye. Te ajoute kantite ki apwopriye nan mwayen kilti (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​nan chak pi, epi chanje mwayen an chak 2-4 jou.

Izolasyon ak kilti selil T CD8 imen

Ajoute menm volim saline nòmal nan san periferik moun ki an sante ki gen anticoagulant pou delye san an antye. Ajoute yon sèten volim nan solisyon separasyon nan yon tib santrifijeur 15mL, tou dousman ajoute san an antye dilye sou miray la tib nan tèt la nan solisyon an separasyon, ak santrifuje nan 750g pou 20min. Apre santrifijasyon an, sèvi ak yon pipèt ak anpil atansyon souse monosit yo nan mitan kouch blan an nan yon tib santrifijeur 15mL, ajoute yon sèten volim nan PBS pou resispann, santrifuje 250g pou 5min, epi jete supernatant la. Apre yo fin ajoute pèl mayetik CD8 imen nan presipite selil yo, selil T CD8 yo te klase pa kolòn klasman LS. Selil T CD8 yo te ajoute nan plak detache a pre-kouvwi ak 5µg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB{_2865578) antikò, epi answit 10ng/mL IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) ak 5µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) te ajoute antikò fonksyonèl kiltive pou 24 èdtan.

Kokilti

Apre organoids yo te enkube ak CAG pou 24 èdtan, yo te ranplase mwayen kilti fre a, ak Lè sa a, organoids yo ak selil T CD8 aktive yo te sispann nan jèl matris la, Lè sa a, sispansyon an te ajoute nan plak la sis-byen epi yo mete yo nan 37 la. enkibatè degre pou 15min, ak Lè sa a, 2mL serom-gratis mwayen kilti konplè te ajoute pou 24hours.

Western blot

Selil MC38 ak HCT-116 yo te simen nan plak sis-pou pou 6 èdtan epi yo te trete ak CAG pou yon lòt 24 èdtan. Selil yo te lave twa fwa ak PBS frèt, epi santrifuje nan 180g pou 5min nan 4 degre. Pwoteyin total la te lysed ak WB-IP lysis ki gen 1 pousan inibitè proteaz pou 30min sou glas. Pwoteyin total te evalye lè l sèvi avèk yon twous kantite pwoteyin BCA. Echantiyon pwoteyin yo te separe pa 10 pousan -12 pousan elektwoforèz jèl poliakrilamid SDS epi yo transfere nan manbràn PVDF (polyvinylidene fluoride) nan 350 mA pou 90min. Manbràn PVDF yo te bloke ak 5 pousan BSA pou 1 èdtan, bann yo ak antikò prensipal ki endike a lannwit lan, ak antikò segondè a enkube pou 90min nan tanperati chanm. Finalman, bann yo te detekte lè l sèvi avèk yon sistèm substra chemiluminescent LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA).

Sitometri koule

Apre dijesyon an nan tisi timè ak sispansyon sèl-selil la te prepare. Tach sifas yo te fèt ak antikò antijèn sifas nan tanpon FCM (Flow Cytometry) (PBS ki gen 1 pousan FBS) ak tache sou glas ak antikò apwopriye pou 30min. Yo te itilize koloran reyaktif (eBioscience) pou elimine selil ki mouri yo. Tach intraselilè cytokine te fèt ak solisyon fiksasyon selil BD / solisyon manbràn ekstraselilè, ak selil yo te fiks ak permeated, ak Lè sa a, tache ak antikò kont sitokin nan tanpon Perm / Wash (BD Biosciences).

Plasmid mutan CTSB transfekte

Selil HCT-116 yo te simen nan 6-plak byen pou 12 èdtan epi yo te transfekte ak CTSB-WT-EGFP oswa CTSB plasmid mutan (Y75A, A77V, ak G198A) pou 36 èdtan.

Entèferans transfè oswa plasmid twòp ekspresyon nan CTSB nan selil MC38 oswa selil HCT-116

Selil MC38 (1 × 106 / byen) yo te vaksinen nan plak 6-byen pou 6 èdtan, Lè sa a, transfekte ak CTSB entèfere RNA (sekans: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT ak Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) pou 48 èdtan, ak nivo ekspresyon mRNA oswa pwoteyin. nan Ctsb ak H2-k1 yo te detekte. Selil HCT-116 (1 × 106 /pi) yo te vaksinen nan 6-plak byen pou 6 èdtan, Lè sa a, transfekte ak entèferans CTSB (sekans: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) oswa plasmid twòp ekspresyon pou 48 èdtan, ak mRNA a. oswa nivo ekspresyon pwoteyin nan CTSB ak HLA-A yo te detekte.

Docking teknoloji

Estrikti 3D CTSB te telechaje nan baz done pwoteyin (PDB ID: 2iPP), epi estrikti CAG yo te telechaje nan PubChem. Pwosesis debakadè a te fèt nan Autodock 2 ak debakadè koryas lè l sèvi avèk yon algorithm annealing simulation ak yon rafineman ki vin apre lè l sèvi avèk yon algorithm jenetik.

Selilè tès chanjman tèmik

Selil MC38 yo te simen nan plak 10cm lannwit lan epi yo te trete ak CAG oswa 0.1 pousan DMSO pou yon lòt 2 èdtan. Selil yo te kolekte, lave ak PBS frèt, epi santrifuje nan 180g pou 5min. Lè sa a, selil yo menm divize an tib santrifujasyon (70µL chak tib) ak chofe pou 3min nan tanperati sa a: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, ak 67 degre, echantiyon yo te refwadi pou 3min nan tanperati ak Lè sa a, kenbe sou glas. Apre sa, echantiyon yo te mete nan yon frijidè nan -80 degre lannwit lan. Echantiyon yo te dekonjle nan tanperati chanm pou 30min ak Lè sa a, nan frijidè a -80 degre pou 4 èdtan. Finalman, echantiyon yo te santrifuje nan 12, 000 g pou 25min, supernatant la te ajoute nan tanpon chaj la, epi analize pa Western blotting.

Tach imunohistochimik

Seksyon parafine nan tisi timè yo te benyen nan xylene pou 20min nan dewax, ak Lè sa a, nan 100 pousan, 75 pousan, ak 50 pousan etanòl pou 10min. Apre tranch yo te sibi reparasyon antijèn ak solisyon reparasyon antijèn sitrat sodyòm, oksijene idwojèn andojèn te inaktive ak 3 pousan oksijene idwojèn. Apre bloke ak 5 pousan serom kabrit pou 1 èdtan, yo te ajoute antikò anti-Ki67 (1:200) epi enkube lannwit lan nan 4 degre. Yo te ajoute polymère anti-sourit/lapen HRP ki make (100µL) epi echantiyon yo te enkube nan 37 degre pou 30min, ki te swiv pa 100µL nan solisyon travay DAB, ak enkubasyon nan tanperati chanm pou 5min. Apre 1min tach ak ematoksilin, echantiyon yo te lave nan 50 pousan, 75 pousan, ak 100 pousan etanòl ak xylene pou 5min, epi yo te itilize jansiv net pou sele fim nan. Yo te obsève fim nan ak foto anba yon mikwoskòp.

Estatistikanaliz

Yo te fè analiz estatistik lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism (V.8.0). Tout rezilta yo eksprime kòm mwayèn ± SEM nan twa eksperyans endepandan. Yo te itilize yon analiz yon sèl nan divèjans ki te swiv pa tès post hoc Dunnett pou evalye diferans yo lè te gen plis pase de gwoup. Yo te itilize tès t Elèv la pou evalye diferans enpòtan ant de gwoup yo. Yo te mete yon siyifikasyon estatistik nan p<0.05.

REZILTA

Analiz milti-omik yon sèl selil nan CAG anpeche kwasans kansè nan kolon transplantasyon nan sourit

Pou envestige si CAG gen yon efè antitumoral, nou premye transplante'tèt selil kansè MC38 nan sourit C57BL/6. Nou te note ke CAG siyifikativman inibit kwasans lan nan timè (sou entènèt figi siplemantè S1A, B). Imedyatman, nou transplante'tèt selil CT26 nan sourit BALB/c epi nou te jwenn ke CAG tou anpeche kwasans timè (sou entènèt figi siplemantè S1C, D).

Pou plis revele mekanis espesifik ki CAG anpeche kwasans timè, nou analize li lè l sèvi avèk teknik scRNA-seq ak scATAC-seq (figi 1A). Nou divize popilasyon selil la an kat gwoup: selil kansè, fibroblast, selil myeloid, ak lenfosit (figi 1B, figi siplemantè sou entènèt S2A, B). Nou te jwenn ke selil kansè yo (52 pousan) ak fibroblasts (41 pousan) te sitou enfiltre nan tisi timè yo, pandan y ap selil iminitè yo te konte pou sèlman 7 pousan. Lè sa a, nou divize selil kansè yo an uit sou-ansanm ak fibroblasts nan twa sou-ansanm (figi 1C-E). Imedyatman, analiz anrichisman jèn ki trè eksprime nan chak popilasyon selil yo te montre ke chemen molekilè MHC-I nan selil kansè yo te anrichi, menm jan yo te anrichi siyal antitumoral selil T ak selil NK (sou entènèt figi siplemantè S2C). Lè sa a, kat gwoup selil yo te jwenn tou lè l sèvi avèk analiz entegrasyon scATAC-seq ak scRNA-seq (figi 2D-G). Apre konparezon an, nou te jwenn ke selil kansè yo (selil C01, C03), CD8 plis selil T, Spp1 plis selil TAM, ak fibroblasts (selil F01 ak F02) parèt nan sekans ATAC (figi 1F, G), epi pi lwen, trè eksprime. faktè transcription yo te rich nan selil sa yo (figi 1H). Atravè analiz sa yo, nou espekile ke CAG anpèchman kwasans timè a gen rapò ak chanjman nan selil sa yo.

Cag ankouraje prezantasyon antijèn selil timè

Pou analize mekanis antitumoral CAG, nou te premye analize popilasyon selil timè a epi divize selil kansè yo an uit sougwoup (figi 2A, B, figi siplemantè sou entènèt S3A). Rezilta yo te montre ke, konpare ak gwoup PBS a, selil gwoup C05 diminye anpil pandan y ap selil gwoup C07 ogmante (figi 2C). Pandan se tan, pou verifye presizyon gwoup selil timè nou an, nou konpare CNV lenfosit ak selil myeloid kòm selil referans. Rezilta yo te montre ke CNV nan selil kansè yo te siyifikativman pi wo pase sa yo ki nan selil iminitè (sou entènèt figi siplemantè S3B). Lè nou analize ti gwoup selil kansè yo, nou te jwenn ke jèn repons entèferon Isg15, Irf7, Ifit3, ak Ifi47 yo te eksprime anpil nan popilasyon selil C07 ak C08 nan gwoup CAG konpare ak gwoup PBS (sou entènèt figi siplemantè S3C). Analiz popilasyon selil timè a te jwenn ke chemen ki gen rapò ak prezantasyon antijèn yo te siyifikativman rich nan plizyè popilasyon selil. Se poutèt sa, nou espekile ke CAG ka ankouraje prezantasyon an antijèn nan selil kansè yo jwe yon wòl antitumoral (figi 2D). Lè sa a, nou te chwazi jèn ki gen rapò ak prezantasyon antijèn yo epi nou te jwenn ke nivo ekspresyon nan gwoup CAG la te siyifikativman pi wo pase sa nan gwoup PBS (figi 2E, figi siplemantè sou entènèt S3D). Nou te jwenn tou ke CAG ankouraje prezantasyon antijèn nan tisi timè (figi 2F, G).

Apre sa, nou te itilize scATAC-seq pou analize rezon espesifik dèyè prezantasyon antijèn selil timè CAG-pwomosyon. Nou te jwenn ke popilasyon selil timè a trè eksprime faktè transkripsyon Fos, Junb, Jund, Fosb, ak Fosl1 (figi 2H, I). Imedyatman, nou te konstwi yon kat jeyografik nan entèraksyon ki genyen ant faktè transkripsyon ak jèn korespondan yo eksplike ke CAG ankouraje ekspresyon de jèn selil timè ki gen rapò ak prezantasyon antijèn (figi 2J). Nan tisi timè yo, nou te jwenn tou ke faktè transkripsyon Junb, Fos, Jund, ak Fosb te siyifikativman overexpressed nan gwoup PBS a anba tretman CAG (figi 2K-N, sou entènèt figi siplemantè S3E-I). Jiskaprezan, nou te jwenn ke CAG ka ankouraje ekspresyon faktè transkripsyon jèn ki gen rapò ak prezantasyon antijèn, kidonk amelyore fonksyon selil kansè yo prezante antijèn yo. Sepandan, ki jan selil kansè sa yo reponn a repons selil iminitè yo rete klè.

Pou dekouvri fenomèn nan ki CAG ankouraje prezantasyon antijèn selil kansè yo, nou te fè analiz trajectoire pou mennen ankèt sou fason selil kansè yo chanje youn ak lòt an repons a repons selil iminitè yo. Nou te jwenn ke, sou tan, selil kansè C07 transfòme nan selil C05, C06, ak C08, ak anrichisman jèn yo te montre tou ke selil kansè yo ta transfòme nan prezantasyon antijèn (figi 3A-E).

CAG amelyore fonksyon touye selil iminitè yo

Rezilta sa yo montre ke CAG ka prezante antijèn selil timè, kidonk amelyore prezantasyon antijèn selil timè ap mennen nan amelyorasyon fonksyon selil iminitè a? Pou konnen sa, nou analize lenfosit ak selil myeloid, respektivman. Rezilta yo te montre ke CAG ankouraje enfiltrasyon nan CD8 plis selil T nan tisi timè, ak enfiltrasyon nan CD8 plis selil T ak selil NK yo te ogmante tou, detekte pa sikometri koule (sou entènèt figi siplemantè S4A-F). Nou te obsève tou ke CAG amelyore ekspresyon jèn Ifitm2, Cxcr6, ak S100a6 nan selil CD8 plis T,

Fcer1g, Gzmb, AW112010, ak Zfp36i2 jèn nan selil NK, ak jèn Nfkbia ak Junb nan CD4 plis selil T (sou entènèt figi siplemantè S4G). Ekspresyon Ifng ak Gzmb nan selil CD8 plis T yo te siyifikativman amelyore tou, jan yo detekte pa sikometri koule (sou entènèt figi siplemantè S4H, I). Anplis de sa, nou te jwenn ke apre tretman CAG, ekspresyon de reseptè inhibitor Lag3, Tigit, ak Havcr2 sou sifas CD8 plis selil T diminye, ak ekspresyon jèn Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5, ak Pdcd1 ki karakterize a. aktivasyon CD8 plis selil T, ogmante anpil (sou entènèt figi siplemantè S4J). Pou plis verifye ke CAG amelyore fonksyon touye CD8 plis selil T yo lè nou ankouraje prezantasyon antijèn timè amelyore, nou transplante'tèt selil CT26 nan timè transplante'tèt nan sourit toutouni epi nou obsève ke CAG pa t 'kapab efektivman anpeche kwasans timè yo (sou entènèt figi siplemantè S4K-M ).

Apre sa, nou analize selil myeloid yo epi nou jwenn ke Spp1 plis selil TAM ogmante apre tretman CAG, pandan y ap kantite C1qc plis selil TAM diminye ak kantite Il1b plis monosit ogmante (sou entènèt figi siplemantè S5A-D). Apre tretman CAG, Spp1 plis TAM ak C1qc plis selil TAM yo te pi fasil pou transfòmasyon TAM pro-enflamatwa. Analiz anrichisman te jwenn ke li sitou konsantre sou Tnf-, Ifn-g, ak chemen an siyal repons enflamatwa (sou entènèt figi siplemantè S5E-H). Ki baze sou rezilta yo mansyone anwo a, nou dedwi ke CAG amelyore rekonesans ak touye fonksyon selil iminitè yo pa ankouraje prezantasyon antijèn nan selil kansè yo. Sepandan, ki jan CAG reglemante pa klè.

Dekouvèt CTSB nan pwoteyin sib CAG pa pèlen

Apre sa, nou pral envestige pwoteyin espesifik CAG sib ki jwe yon wòl antitumoral. Nou te chwazi selil kansè yo kòm objè rechèch la paske nou te jwenn ke CAG ka amelyore prezantasyon antijèn selil kansè yo, kidonk amelyore fonksyon touye selil iminitè yo. Nou te fè premye sentèz derive biotin nan CAG epi nou te jwenn ke sèlman 3-OH te kapab reyaji (sou entènèt figi siplemantè S6A). Lè sa a, nou te envestige si CAG-biotin tou ankouraje ekspresyon de jèn ki gen rapò ak prezantasyon antijèn nan liy selil timè sourit MC38 la. Rezilta yo montre ke CAG-biotin pa t afekte ekspresyon jèn H2-K1, Cd74, ak Anxa1 (figi siplemantè sou entènèt S6B-D).

Se poutèt sa, nou te itilize metòd rechèch sib TRAP anvan an nan laboratwa a.32 CAG ak DMSO te tou de enkube ak liy selil MC38 (figi 4A). Nou te chwazi pwoteyin ki gen FC Greater than or equal to 2 ak ap mwens pase oswa egal a 0.05 kòm kandida sib pwoteyin CAG la. Apre prensip ki fè konnen lyezon ti molekil ak pwoteyin ap mennen nan efikasite etikèt lizin, nou chwazi CTSB pou etid la (figi 4B). Apre sa, nou te itilize tès selilè chanjman tèmik (figi 4C) ak mikwoskal tèrmoforèz (MST) (figi 4D) pou verifye obligatwa ki genyen ant CAG ak CTSB, epi li te jwenn ke afinite ant CAG ak CTSB te 26.6nM (figi 4D). Imedyatman, nou prevwa sit obligatwa ant CAG ak CTSB dapre estrikti kristal pwoteyin CTSB nan bibliyotèk PDB la. Nou te jwenn ke gwoup idroksil yo nan tou de bout CAG ak sit ALA77 ak GLY198 nan CTSB yo te mare pa yon kosyon idwojèn, pandan y ap sit TYR75, PRO76, ak ALA173 nan CAG ak CTSB yo te mare pa fòs van der Waals (figi 4E) . Pou verifye sit lyezon ant CAG ak CTSB, nou transfekte plasmid mutan CTSB nan selil HCT-116 yo. Rezilta yo montre ke afinite ant plasmid mutan nan A77V ak G198A ak CAG te dè santèn de fwa pi wo pase plasmid WT la (figi 4F, G). Nan pwochen seksyon an, nou eksplore mekanis espesifik nan ki CAG jwe yon wòl antitumoral atravè CTSB.

【Pou plis enfòmasyon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】