Tetrandrin soulaje blesi Podocyte atravè kalsyòm ki depann sou blòk siyal Calpain-1

Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com

Yin Ding, Xuanli Tang, Yuhui Wang, Dongrong Yu, Caifeng Zhu ak Jin Yu*

Résumé

Background:Podosit yo te vin tounen yon sib enpòtan pou entèvansyon nan pwoteyinrenmaladi. Anpil etid te rapòte ke twòp ekspresyon reseptè tranzitwa potansyèl cation chanèl pwoteyin 6 (TRPC6) nan blesi podocyte upregulate entracellular Ca2 plis foul ak stimul Ca2 plis -depandan proteaz calpain-1 siyal. Dwòg tradisyonèl Chinwa a, tetrandrin, yon nonselective Ca2 plis kanal blocker, te itilize depi lontan pou trete kwonik.renmaladi. Rechèch sa a te vize eksplore mekanis posib ki kache pwopriyete anti-proteinorik tetrandrin.

Metòd:Nou te envestige patisipasyon tetrandrin nan Ca2 plis depandan calpain-1 siyal nan podosit sourit ak rat nefropati adriamycin-induit. Cyclosporine A (CsA) ak U73122 yo te itilize kòm kontwòl pozitif. Yo te egzamine viabilite selil, sitotoksisite, konsantrasyon Ca2 plis, aktivite calpain, ak nivo ekspresyon mRNA ak pwoteyin nan chemen siyal kalpain-1. Chanjman klinik ak patolojik yo te mezire.

Rezilta:Tetrandrin diminye Ca2 entraselilè ak aflu nan podosit TRPC6-ki twòp eksprime. Nan tou de etid in vitro ak nan vivo, administrasyon an nan tetrandrin downregulated aktivite calpain ak ekspresyon nan calpain-1 epi restore ekspresyon an nan en Talin-1 ak nephrin. Konpare ak CsA, tretman tetrandrin te montre efè inhibitor siperyè sou aktivite calpain ak ekspresyon calpain-1.

Konklizyon:Tetrandrin gen potansyèl terapetik nan domaj podosit lè li bloke aktivasyon Ca2 plis depandan nan chemen siyal calpain-1. Tetrandrin redwi proteinuria, amelyore fonksyon ren, ak soulaje domaj patolojik ren yo.

Mo kle:Tetrandrin, Podocyte blesi, Transient reseptè potansyèl kation chanèl pwoteyin 6, Calpain-1

Cistanche tubulosa anpeche maladi ren, klike la a pou jwenn echantiyon an

Background

Podosit yo se yon avantou pou kenbe pèmeyabilite selektif nan baryè filtraj glomerulè ak entegrite estriktirèl glomerulèr. Se blesi podocyte tipikman ki asosye ak maladi ren pwoteyin, ki gen ladan glomerulosclerosis segmantal fokal (FSGS), nefropati manbràn, maladi chanjman minimòm, ak dyabetik.renmaladi [1-4]. Pwoteksyon ak restorasyon nan podosit soti nan faktè danjere konstitye yon gwo defi nan tretman an siksè nan maladi ren.

Podosit yo se selil ki trè espesyalize, ki diferan nan tèminal ki sitiye deyò manbràn sousòl glomerulè a ​​epi ki karakterize pa pwosesis pye yo. Malfonksyònman nan règleman siyal kalsyòm nan podosit mennen nan podocyte actin dezòganizasyon sitoskelèt, deformation pwosesis pye, dezòd nan dyafram nan fant, ak proteinuria. Transient reseptè potansyèl cation chanèl pwoteyin 6 (TRPC6), yon roman fant diaphragm-asosye pwoteyin nan podocytes, yo te idantifye kòm yon nonspecific Ca2 plus -conducting ion channel [5-8]. Ekspresyon glomerulè TRPC6 ogmante nan anpil maladi éréditèr ak akeri pwoteyin. Etid anvan yo te rapòte ke overexpressing nan TRPC6 nan podocytes deklannche yon ogmantasyon siperyè nan entracellular Ca2 plis foul, ki kwè yo responsab pou aksidan selil podocyte. Ogmantasyon chaj kalsyòm nan podosit yo aktive chemen siyal en, tankou calpain-1, Talin-1, nephrin, ak calcineurin, pou modile aktivite oswa ekspresyon jèn sib yo [9-12]. Fangji Huangqi Tang se yon medikaman tradisyonèl tradisyonèl Chinwa (TCM) pou tretman sendwòm nefrotik [13]. Li konsiste de sis remèd fèy: Radix Stephania Tetrandra (rasin Stephania tetrandra), Radix Astragali (rasin Astragalus membranaceus), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (rasin Atractylodes macrocephaly), Radix Glycyrrhizae (rasin Glycyrrhizae), Rhizoma Zyrrhizis. (rasin yo nan Zingiber Officinale) ak Fructus Ziziphi Jujubae (Fructus nan Ziziphus jujuba) [1]. Tetrandrin, youn nan eleman prensipal yo aktif nan Radix Stephania Tetrandra, yon nonselective Ca2 plis bloke kanal, yo te teste nan esè klinik epi yo te endike soulaje proteinuria ak amelyore fonksyon ren [14, 15]. Yon etid anvan te demontre efè bloke tetrandrin sou siyal RhoA depandan Ca2 plis nan podosit [16], men mekanis ki kache yo pa te elisidé. Isit la, TRPC6-modèl twòp eksprime yo te devlope an vitro ak in vivo. Apre administrasyon tetrandrin, chanjman nan TRPC6-depandan Ca2 plis siyal yo te evalye, ki gen ladan sib en, calpain-1, Talin-1, nephrin, ak calcineurin. Cyclosporine A (CsA), yon inibitè nan calcineurin, lajman ki itilize nan tretman maladi proteinuria) [17] ak U73122, yon inibitè nan ouvèti kanal TRPC6 [18] yo te itilize kòm kontwòl pozitif.

Metòd

Kilti selil ak konstriksyon plasmid

Selil liy selil podocyte (MPC5) sourit imòtalize kondisyonèl, yo te jwenn nan men Pwofesè Peter Mundel (Mount Sinai School of Medicine, USA), yo te kenbe nan 33 degre pou pwopagasyon, ak Lè sa a, deplase nan 37 degre pou diferansyasyon. Plasmid ekspresyon TRPC6 te konstwi pa klonaj tout longè sekans ADN kodaj jèn TRPC6 la nan sit EcoRI/BamHI vektè pCDH-GFP-PURO a epi pake nan lentivirus. Lè yo te diferansye ak grandi nan apeprè 80 pousan konfluans, podosit yo te simen nan yon dansite selil 4 × 104 pou chak cm2 epi yo te enkube nan konbinezon ak TRPC6-lentiviris overexpressing. Liy selilè TRPC6 ki estab, verifye lè l sèvi avèk pwoteyin TRPC6 ak ekspresyon mRNA, yo te itilize pou plis eksperyans. Se konsa, MPC5 podocytes yo te divize an twa gwoup, gwoup kontwòl nòmal (NC), gwoup lentivirus vid (Lv-NC), ak gwoup TRPC6-overexpressing (OverTRP).

In vitro selil dwòg tretman ak cytotoxisite tès

Yo te jwenn aksè nan ranpabilite selil yo lè l sèvi avèk tès selil konte {{0}} (CCK-8), dapre enstriksyon manifakti a. Yon total de 5000 podosit MPC5 pou chak pui yo te grandi an triple nan 96-plak byen yo. Selil yo te trete ak yon seri de CsA (0-2μmol / L; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ak tetrandrin (0-40μmol / L; Sigma Aldrich) nan 37 degre pou 48h. Lè sa a, te ajoute CCK -8 nan plak yo (10μL / byen), ki te Lè sa a, enkube nan fè nwa a pou 2h. Yo te mezire absorpsyon nan 450nm lè l sèvi avèk yon lektè microplate (BioTek Instruments, USA). Cytotoxicity te teste pa quantifying, laktat dehydrogenase (LDH) lage lè l sèvi avèk Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories, Japon). Kòm yon kontwòl pozitif, selil yo te trete ak 10μmol / LU73122 (Cal biochem, USA) nan 37 degre pou 10min.

Ekstraksyon RNA ak reyaksyon chèn transkriptaz ranvèse-polymerase (qRT-PCR)

RNA total te prepare nan selil kiltive akrentisi yo itilize RNAiso Plus reyaktif (Takara, Japon) ak ranvèse transkripsyon nan cDNA PrimeScript™ RT Master Mix kit (Takara) dapre pwotokòl manifakti yo. qRT-PCR te fèt lè l sèvi avèk Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Almay). Sekans premye sib ak jèn referans yo endike nan Tablo Siplemantè S1. Done yo te kolekte lè l sèvi avèk sistèm PCR an tan reyèl ABI Prism 7900HT FAST. Kantifikasyon relatif ekspresyon jèn sib yo te nòmalize lè l sèvi avèk metòd konparatif 2-ΔΔCt la. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) te itilize kòm kontwòl entèn la.

Western blotting

echantiyon pwoteyin total yo te ekstrè nan selil kiltive akrentisi. Konsantrasyon pwoteyin yo te detèmine lè l sèvi avèk yon twous tès pwoteyin BCA (Thermo Fisher Scientific). Echantiyon yo te separe sou yon 10 pousan sodyòm dodecyl silfat-polyacrylamid jèl epi transfere sou yon manbràn polyvinylidene difluoride. Lè sa a, manbràn an te bloke lannwit lan nan 4 degre ak antikò prensipal, sètadi anti-TRPC6 (Santa Cruz, USA), anti-kal doulè -1 (Abcam, UK), anti-Talin-1 (Abcam) , anti-nephrin (Santa Cruz), ak anti-calcneurin (Abcam). Apre lave, yo te enkube manbràn nan ak IgG antilapen kabrit (H plis L; Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA). Manbràn an te trete tou pou detekte GAPDH (Abcam) pou chaje egal. Gwoup yo rekonèt pa antikò prensipal la yo te vizyalize, ak dansite optik nan bann pwoteyin yo te analize lè l sèvi avèk lojisyèl TanonImage (Tanon, Lachin).

Detèminasyon cytosolic Ca2 plis nan kiltive podocytesMPC5 podocytes te simen epi trete ak tetrandrin, CsA, ak U73122 pou 48h, 48h, ak 10min, respektivman. Lè sa a, podosit yo te enkube ak RPMI-1640 konplete ak 10μM Fluo-3AM (Dojindo Laboratories) pou 30min nan fè nwa a. Apre sa, yo te imedyatman lave ak saline tanpon fosfat, kote yo te kenbe ak eksite nan 488nm. Konsantrasyon relatif nan cytosolic Ca2 plis ion te evalye pa mezire entansite fliyoresans lè l sèvi avèk yon sistèm Zeiss lazè konfokal D (Zeiss, USA).

Mezi nan aktivite calpain

Aktivite Calpain te detèmine lè l sèvi avèk Calpain Activity Assay Kit ki soti nan Abcam Inc., dapre pwotokòl manifakti a. Supernatant a (150 uL) nan podosit oswarentisi yo te pran nan solisyon tanpon apwopriye (145mmol/L Nacl, 100mmol/L Tris-HCL, pH7.3) ak 0.15mLN-Succinyl-Leu-Tyr-AMC (500 umol/L). Apre yon 1- enkubasyon nan 37 degre nan fè nwa a, echantiyon yo te li lè l sèvi avèk yon fliyomèt ekipe ak yon filtè eksitasyon 360nm ak yon filtè emisyon 440nm.

Modèl rat Adriamycin-induced nephropathy (ADRN) Ki baze sou Fermi apwoksimasyon gwosè echantiyon [19] ak diferans proteinuria ant gwoup kontwòl ak modèl nan eksperyans preliminè nou yo, yo te detèmine kantite total rat ki nesesè nan etid nou an. Yon total de 56 rat gason ki an sante Sprague-Dawley, ki peze apeprè 200 g ak ki gen laj apeprè 8 semèn (Zhejiang Institute of TCM), yo te owaza divize an sèt gwoup (n =8 rat/gwoup), sètadi gwoup ADR a, ADR plis. gwoup tetrandrin dòz ki ba (4mg/kg/d), ADR plis gwoup dòz presegondè tetrandrin (8mg/kg/j), ADR plis gwoup dòz tetrandrin (16mg/kg/j), ADR plis gwoup trete CsA (30mg). /kg/d), ADR plis dòz presegondè tetrandrin (8mg/kg/d) an konbinezon ak gwoup CsA (30mg/kg/d), ak gwoup NC. Rat nan gwoup modèl la ak gwoup tretman dwòg yo te anestezi ak yon piki intraperitoneal nan idroklorid ketamin (50mg / kg), ak de dòz ADR (4mg / kg) yo te sou fòm piki nan venn nan caudal yo devlope modèl la rat FSGS. Apre 12 semèn, yo te kolekte echantiyon pipi rat yo pou 24 èdtan lè l sèvi avèk kalòj metabolik yo, ki te swiv pa koleksyon san ak rekòlte nan.ren. Yo te obsève efikasite klinik, epi chanjman ki fèt nan 24-h pwoteyin pipi, albumin plasma, kreyatinin serik (Scr), ak nivo nitwojèn nan pipi san (BUN) yo te mezire lè l sèvi avèk twous dyagnostik ki disponib nan komès ak yon analiz chimi otomatik (HITACHI 7180). ).

Tout pwosedi eksperimantal ki enplike itilizasyon bèt yo te apwouve pa Komite Etik sou Eksperyans Animal nan Zhejiang Institute of TCM (Tianmushan Road No.132) epi yo te entèdi fèt dapre prensip ki endike nan Gid NIH pou Swen ak Itilizasyon Bèt Laboratwa. .

Tach istolojik, mikwoskòp elèktron, ak analiz

Ratrenyo te fikse nan paraformaldehyde, dezidrate lè l sèvi avèk yon seri gradye nan etanòl, ak entegre nan parafine. Seksyon (5-μm-epè) yo te tache ak ematoksilin ak eozin (H&E) ak trikrom Masson a epi yo te egzamine anba yon mikwoskòp optik. Yo te pèfuze ren yo epi yo te fikse ak glutaraldeyid epi yo te koupe an 1-blòk tisi mm3 pou epoksidik. Yo te fè mikwoskopi elektwonik lè l sèvi avèk pwosedi estanda. Senk ultra-mikrograf yo te jwenn owaza nan chak echantiyon. Pousantaj fizyon pwosesis pye Podocyte (PFR) te kalkile lè l sèvi avèk fòmil sa a: PFR (pousan)=∑LFP / ∑LBM×100 pousan, kote ∑LFP se longè total pwosesis pye kole ak ∑LBM se longè total manbràn sousòl kapilè periferik la (BM).

Analiz estatistik

Done yo eksprime kòm mwayen ± erè estanda nan mezi epi yo analize lè l sèvi avèk SPSS 20.0 (IBM Statistics SPSS, US) ak GraphPad Prism 6 pou Windows (GraphPad Software Inc., USA). Distribisyon nòmal te evalye pa simityè qq ak tès SW la. Done yo te montre yon distribisyon nòmal. Lè de gwoup done yo te konpare, echantiyon endepandan t-tès yo te aplike. Diferans ki genyen ant twa oswa plis gwoup endepandan yo te konpare lè l sèvi avèk yon analiz yon sèl-fason nan divèjans ki te swiv pa tès post hoc Tukey a. Yo te mete siyifikasyon estatistik nan p<>

Rezilta yo

Seleksyon nan konsantrasyon optimal ak sitotoksisite nan tetrandrin, CsA, ak U73122

Yo te itilize tès CCK{{0}} pou detekte viabilite selil yo. Jan yo montre nan Fig. 1a ak b, konsantrasyon maksimòm 10μmol/L tetrandrin ak 0.1μmol/L CsA pa t afekte viabilite MPC5 podocytes. Egzamen lage LDH la te konfime ke 10μmol / L tetrandrin ak 0.1μmol / L CsA pou 48h pa te montre okenn toksisite, tandiske 10μmol / LU73122 pou 10min te montre toksisite espere (figi 1c). Se poutèt sa, eksperyans selil ki vin apre yo itilize tetrandrin ak CsA nan 10μmol / L ak 0.1μmol / L, respektivman.

Tetrandrin diminye Ca2 intraselilè plis infux nan selil MPC5 kiltive yo ki twòp eksprime TRPC6.

Sèvi ak transfèksyon plasmid, yo te etabli avèk siksè yon modèl selil TRPC6 twòp ekspresyon nan podosit MPC5. qRT-PCR ak analiz Western blot te demontre ke nivo ekspresyon TRPC6 nan gwoup Over-TRP te ogmante siyifikativman konpare ak gwoup NC ak Lv-NC (p).<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

D 'fluoresans (figi 2c) ak analiz semi-quantitative (figi 2d) endike ke twòp ekspresyon nan TRPC6 amelyore entraselilè Ca2 plis foul, tandiske pa te gen okenn diferans evidan ant gwoup yo NC ak Lv-NC. Lè sa a, dis selil gwoup OverTRP yo te trete ak dwòg eksperimantal yo. Gwoup pretretman dwòg yo (tetrandrin, CsA, ak U73122) te gen efè inhibition sou entraselilè Ca2 plis foul (P).<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

Efè tetrandrin sou aktivite ak ekspresyon calpain-1, calcineurin, Talin-1, ak nephrin nan selil MPC5

Li te montre ke entracellulaire Ca2 plus aktive calpain, yon Ca2 plus-depandan cysteine ​​protease, ak calcineurin, yon Ca2 plus / calmodulin-depandan fosfataz pwoteyin. Nan liy ak obsèvasyon anvan yo, nivo aktivite ak ekspresyon calpain ak calcineurin nan gwoup Over TRP yo tout te pi wo pase sa yo ki nan gwoup NC ak Lv-NC (p.<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0.05) ak nefrin (p<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0.05; Figi 3f, g, j, ak k).

Jèl plen longè ak blots yo te enkli nan Figi Siplemantè S1.

Eksperyans in vivo yo itilize yon modèl ADRN pou rat Pou karakterize repons a anpèchman tetrandrin nan siyal TRPC6/calpain-1 an vivo, yo te devlope yon modèl ADRN nan rat. MRNA ak pwofil ekspresyon pwoteyin TRPC6 yo te ogmante siyifikativman nan gwoup ADRN konpare ak sa ki nan rat yo manje nòmal-chow (gwoup NC; p.<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

Tretman ak CsA pa t bloke deklanchman calpain ki te pwovoke pa twòp ekspresyon TRPC6 (figi 4c), e efè a pa t osi solid ke tetrandrin sou ekspresyon pwoteyin cal -1 (p).<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

Tretman ak CsA pa t bloke aktivasyon calpain ki te pwovoke pa twòp ekspresyon TRPC6 (figi 4c), e efè a pa t osi solid ke tetrandrin sou ekspresyon pwoteyin calpain-1 (p.<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

Anplis de sa, yo te evalye ekspresyon Talin-1 ak nephrin (figi 4h, i, l, ak m). Tou de Talin-1 ak nivo nephrin yo te redwi nan rat ADRN konpare ak sa ki nan gwoup NC a (p.<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

Jèl plen longè ak blots yo te enkli nan Figi Siplemantè S2.

Tetrandrin siprime pwogresyon ADRN ak sove efè istopatoloji Tetrandrin sourenfonksyon nan rat Sprague-Dawley trete ak ADRN te imedyatman evalye (Fig. 5a-d). Pa te gen okenn premye diferans enpòtan nan 24-h proteinuria, Scr, ak nivo BUN nan mitan gwoup yo. Douz semèn apre, nivo 24h-proteinuria, Scr, ak BUN nan gwoup ADRN yo te ogmante estatistik, tandiske albumin plasma yo te siyifikativman redwi, konpare ak gwoup NC a (P).<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0.05; done yo pa montre).

Chanjman nan istomorfoloji yo montre nan Figi 6. Nan rat ADRN, H & E ak tach Masson te montre FSGS, fibwoz tubulointerstitial, ak enfiltrasyon selil enflamatwa entèrstisyèl ren. Anplis de sa, imaj mikwoskòp elèktron nan glomeruli revele pwosesis pye podocyte trè efase, angrese ak fusion ak 80-100 pousan PFR podocyte. Rat nan sous-gwoup tetrandrin yo (gwoup dòz presegondè ak gwo dòz) te prezante ak mwens blesi pase gwoup ADR a ak plizyè nivo, ak amelyorasyon nan gwoup dòz segondè a te depase gwoup dòz mwayen an. Nan gwoup ki te trete ak tetrandrin ki ba, mwayen ak gwo dòz, PFR podocyte yo te 70-80 pousan, 50-60 pousan, ak 30-40 pousan, respektivman. Done sa yo sijere ke tetrandrin pwoteje kont domaj estriktirèl nan glomeruli ren pwovoke pa administrasyon ADR. Pa te gen okenn diferans enpòtan nan chanjman patolojik anba yon mikwoskòp limyè nan mitan gwoup yo (gwo dòz tetrandrin, CsA, ak tetrandrin nan konbinezon ak CsA). Anplis de sa, podocyte PFR nan gwoup ADRN CsA-trete a te menm jan ak sa ki nan gwo dòz gwoup tetrandrin-trete yo.

Diskisyon

Podocytes yo te vin de pli zan pli enpòtan kòm yon sib pou entèvansyon nan FSGS ak maladi nefrotik ki gen rapò [20, 21]. Isit la, ki baze sou done in vitro ak nan vivo, li te

te demontre ke pwoteksyon podocyte ak efè antiproteinuric nan tetrandrin, yon ki pa selektif Ca2 plis bloke kanal, te medyatè atravè anpèchman nan entraselilè Ca2 plis foul ak Ca2 plis -depandan calpain-1 kaskad siyal, ki gen ladan Talin-1 , nephrin, ak calcineurin. Tetrandrin te pi efikas pase nan anpeche calpain-1 anpèchman.

Dapre rezilta anvan yo, podocyte TRPC6 se kanal la ki sitou kontribye nan chanjman nan Ca2 plis foul nan kondisyon nòmal ak patolojik [7, 22]. Li se lajman konnen ke aktivite calpain depann sou nivo kalsyòm ak ki asosye akrenblesi, patikilyèman ren anti-glomerular BM aksidan [10, 23]. Pami 15 izofòm kalpain yo idantifye, kalpain -1 dènyèman te montre lyen aktivite TRPC6 ak blesi podosit [24]. Yo rapòte ke Calpain-1 fende pwoteyin ancrage Talin-1 ki asosye ak sitoskelèt podocyte a ak pwoteyin dyafram fant la, nephrin, ki deranje entegrite podosit yo epi ki pwovoke proteinuri grav [8-12, 16]. Calcineurin se yon fosfataz depandan Ca2 plis ki te deja demontre li jwe yon wòl nan podosit akrenfonksyon. Prèv akimile de pli zan pli endike ke calpain ka fann ak aktive calcineurin nan yon fason pwoteolitik [25, 26]. Etid sa a te kreye modèl TRPC6 overexpression pa enfeksyon viris nan podosit kiltive ak piki adriamycin nan rat SD. An akò, nou te montre ke TRPC6-medyatè Ca2 plis foul aktive aktivite calpain la, ak ekspresyon calpain manm fanmi calpain-1. Ogmantasyon kalpain-1 answit te fende Talin an-1 ak nefrin.

Tetrandrin se yon alkaloid ki sòti nan yon plant medikaman tradisyonèl Lachin e li se yon bloke ki pa selektif Ca2 plis chanèl. Isit la, li te reyafime ke tetrandrin inibit TRPC6 twòp ekspresyon ak redwi foul la nan Ca2 plis nan tou de selil ak rat overexpressing TRPC6, jan dokimante deja [16]. Sa ki pi enpòtan, etid sa a konsantre sou efè entèvni nan tetrandrin sou chemen an siyal kalsyòm-depandan an. Li te obsève ke, kontrèman ak CsA, tetrandrin redwi aktivite kalsyòm-aktive net proteaz (calpain). Anplis de sa, tetrandrin te diminye ekspresyon fanmi proteaz kalsyòm aktive, calpain-1, epi retabli ekspresyon deregleman Talin-1 ak nephrin. An konparezon ak CsA, administrasyon tetrandrin te montre efè siperyè sou inaktivasyon calpain ak ekspresyon calpain regilasyon -1. Rezilta sa yo te montre ke tetrandrin gen potansyèl terapetik nan domaj podosit lè yo bloke TRPC6-activation depandan nan chemen siyal calpain-1.

Yo idantifye fosfolipas C (PLC) kòm yon patnè TRPC 6-obligatwa [27]. U73122 inibit PLC pou mwens diacylglycerol pwodwi epi ouvèti kanal TRPC6 redwi [18, 24]. Se konsa, U73122 te itilize an paralèl kòm yon kontwòl pozitif, epi li te montre yon efè aparan nan diminye entraselilè Ca2 plis foul, anpeche aktivite calpain, ak ekspresyon calpain-1 nan podosit ki twòp eksprime TRPC6. Sepandan, tès cytotoxisite an vitro te montre aparan toksisite podocyte.

Nan etid sa a, apre 12 semèn piki ADR, proteinuri grav, ipoalbuminemi, ak nivo BUN ak Scr ki wo te evidan nan rat ki te trete ADR--. Mikwoskospi limyè revele FSGS, fibwoz tubulointerstitial, ak enfiltrasyon selil enflamatwa entèstitis ren nan rat ADRN yo. Mikwoskopi elektwonik demontre efasman toupatou nan pwosesis pye yo. Done yo an vivo plis demontre ke terapi tetrandrin ka diminye proteinuri, amelyore fonksyon ren, ak diminye pwogresyon nan glomerulosclerosis. Apre tretman tetrandrin, chanjman patolojik anba mikwoskòp limyè ak mikwoskòp elèktron, 24-h proteinuria, albumin plasma, Scr, ak BUN nan rat ADRN yo te amelyore anpil konpare ak sa yo ki nan gwoup NC a.

Inibitè calcineurin a, CsA, ki depi lontan te itilize pou trete proteinuricrenmaladi [28]. Calcineurin enpòtan klinikman kòm yon sib dirèk nan dwòg imunosuppressive CsA [17, 29]. CSA diminye ekspresyon calcineurin ak diminye faktè nikleyè kalsineurin nan selil T aktive [30-32]. Prèv ki sot pase yo sipòte efè estabilize CsA sou podocyte actin cytoskeleton, tankou synaptopodin pa bloke dephosphorylation nan calcineurin medyatè nan synaptopodin [17]. Li te demontre tou ke calpain ka fann ak aktive calcineurin nan yon fason pwoteolitik [25, 26]. Done ki soti nan etid sa a reyafime ke CsA inibit aktivite calcineurin ak ekspresyon pi fò pase tetrandrin. Kòm deja rapòte, CsA pa parèt dirèkteman afekte aktivite calpain.

Yon gwo limit nan etid la se te echèk nan demontre yon efè depann de dòz nan mitan sous-gwoup tetrandrin yo (gwoup ki ba-dòz, mitan-dòz, ak gwo dòz). Yon eksplikasyon posib ta ka ke ranje dòz nou te itilize a te twò wo pou rat. Anplis de sa, diferans endividyèl yo nan eksperyans bèt la ka konsiderableman pi gran pase diferans dòz yo. Gwosè echantiyon relativman ti ka diminye pouvwa estatistik la. Se poutèt sa, plis etid ki gen ladan dòz konsiderableman pi piti ak gwosè echantiyon apwopriye yo bezwen rann kont seri dòz egzak la ak efè tetrandrin nan rat ARDN.

An rezime, nan règleman an nan chemen siyal kalsyòm, tetrandrin montre yon efè inhibition evidan sou calpain -1, tandiske CsA dirèkteman enfliyanse anpèchman calcineurin. Konklizyon sa yo sijere ke tretman konbine tetrandrin ak CsA ka afekte plizyè objektif rezo siyal kalsyòm pou amelyore rezilta klinik yo. Etid konfimatè yo nesesè pou valide obsèvasyon sa yo ak pou elicide mekanis efè sinèrjik yo.

Abreviyasyon yo

FSGS: Focal segmental glomerular sclerosis; MCD: Maladi chanjman minimòm; MN: Nefropati manbràn; DKD: Dyabetikrenmaladi; TRPC6: Transient reseptè potansyèl kasyon chanèl pwoteyin 6; Ca2 plis: Kalsyòm; TCM: Classic tradisyonèl medikaman Chinwa; Tet: Tetrandrin; CsA: Cyclosporine A; Scr: kreyatinin serik; BUN: Azòt san pipi; PFR: Pwosesis pousantaj fizyon; BM: Manbràn sousòl; ADRN: Adriamycin-induit nephropathy; PLC: Fosfolipas C.

References

1. Garg P. Yon revi de biyoloji podocyte. Am J Nephrol. 2018;47(Suppl 1):3–13.

2. Khalilpourfarshbaf M, Hajiaghaalipour F, Selvarajan KK, et al. Terapi mesenchymal ki baze sou selil souch kont domaj podosit nan nefropati dyabetik. Tissu Eng Regen Med. 2017;14:201–10.

3. Nagata M. Podocyte aksidan ak konsekans li yo. Kidney Int. 2016;89:1221–30.

4. Pavenstädt H, Kriz W, Kretzler M. Biyoloji selilè nan podosit glomerulèr la. Physiol Rev. 2003;83:253–307.

5. Riehle M, Büscher AK, Gohlke BO, et al. TRPC6 G757D pèt-of-fonksyon mitasyon asosye ak FSGS. J Am Soc Nephrol. 2016;27:2771–83.

6. Ilatovskaya DV, Blass G, Palygin O, et al. Yon chemen NOX4/TRPC6 nan règleman kalsyòm podocyte ak domaj ren nan maladi ren dyabetik. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1917–27.

7. Reiser J, Polu KR, Möller CC, et al. TRPC6 se yon chanèl glomerulè ki asosye ak dyafram ki nesesè pou fonksyon ren nòmal. Nat Genet. 2005;37:739–44.

8. Huang H, Ou Y, Lin X, et al. Anpèchman nan chemen siyal TRPC6 soulaje blesi podocyte pwovoke pa TGF - 1. Selil Physiol Biochem. 2017;41:163–72.

9. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Proteaz ki depann de kalsyòm Calpain-1 lye aktivite TRPC6 ak blesi podosit. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–109.

10. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. Aktivasyon Calpain ak sekresyon ankouraje blesi glomerulèr nan glomerulonefrit eksperimantal: prèv ki soti nan sourit calpastatin-transgenic. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–23.

11. Tian X, Kim JJ, Monkley SM, et al. Talin1 ki asosye ak Podocyte enpòtan anpil pou antretyen baryè filtraj glomerulèr. J Clin Investig. 2014;124:1098–113.

12. Jiang L, Ding J, Tsai H, et al. Twò-eksprime reseptè tranzitwa potansyèl cation chanèl 6 nan podocytes pwovoke reyajman sitoskelèt atravè ogmantasyon nan entraselilè Ca2 plis ak aktivasyon RhoA. Exp Biol Med (Maywood). 2011;236:184–93.

13. Liu X, Zhou QG, Zhu XC, et al. Depistaj pou konpozan potansyèl aktif nan Fangji Huangqi tang sou tretman sendwòm nefrotik lè l sèvi avèk metabolomik entegre ki baze sou "korelasyon ant pwofil chimik ak metabolik". Devan Pharmacol. 2019;10:1261.

14. Liu KC, Lin YJ, Hsiao YT, et al. Tetrandrin pwovoke apoptoz nan selil nasopharyngeal imen NPC-TW 039 pa estrès retikul andoplasmik ak chemen Ca2 plis / Calpain. Antikanse Res. 2017;37:6107–18.

15. Wang YJ, Li LQ, Solèy W, et al. Pwojè optimize nan medikaman tradisyonèl Chinwa nan trete maladi ren kwonik etap 3: yon jijman kontwole owaza multisant doub-avèg. J Etnopharmacol. 2012;139:757–64.

16. Yu J, Zhu C, Yin J, et al. Tetrandrin siprime potansyèl reseptè tranzitwa Cation Channel pwoteyin 6 overexpression-induit domaj podocyte atravè blokaj nan RhoA / ROCK1 siyal. Drug Des Devel Ther. 2020;14:361–70.