Pati I.: Organoid ki te pwodwi nan selil pwojenitè eritwoyid nan pasyan ki gen maladi politik dominan

pou plis information:ali.ma@wecistanche.com

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice, & et al.

Entodiksyon

Politik dominan dominanaladi ren(ADPKD) se kòz ki pi souvan jenetik nan maladi ren kwonik (CKD) atravè lemann, epi li se youn nan maladi yo ki pi répandus monogenic, ki afekte yon popilasyon estime nan 1: 400-1000 [1]. ADPKD (Otosomal dominan politikaladi ren) ki te koze pa mitasyon nan PKD1 la (kalite 1 maladi politik ren) ak PKD2 (kalite 2 maladi politik ren) jèn, kodaj pou politik-1 (PC1) ak politik-2 (PC2), respektivman, sa ki lakòz chanjman sibstans ak fòmasyon sibstans. Tou de pwoteyin modile anpil wout molekilè kòm byen ke tisi mòfojèn ak fonksyon. Sepandan, mekanis yo molekilè egzak kache sistogenesis rete klè. Li te byen aksepte ke yon mitasyon mitasyon jèmline ki te swiv pa yon mitasyon somatik (dezyèm frape)nan ale nòmal la nesesè pou cystogenesis [2,3]. Anplis, ki baze sou rezilta ki soti nan modèl sourit òtoloji, li te demontre ke yon ensilt ren adisyonèl (twazyèm-frape) obligatwa pou kwasans rapid ak grav kwasans siksè nan ren ki gen matirite [4,5]. Li sanble ke nan moun, pifò frape rive pandan devlopman ren, ki mennen nan fòmasyon sistik ak kwasans menm nan utero. Se poutèt sa, gravite a ak pousantaj la nan pwogresyon maladi ren ki soti nan PKD1 (kalite 1 maladi politik ren) ak PKD2 (kalite 2 maladi politik ren) mitasyon ka enfliyanse pa plizyè faktè, ki gen ladan tan an nan inaktivasyon nan jèn yo, etap devlopman ren, enfliyans anviwònman an, prezans nan lesion ren konkomante, ak divèsite nan mitasyon jenetik.

Malgre ke te gen done innumable konsènan mekanis yo patolojik nan ADPKD (Otosomal dominan politik dominanaladi ren) kolekte nan syans anplwaye òtoloji ak modèl sourit nonorthologous, sèlman yon ti ponyen nan syans ki konsantre sou modèl selilè imen nan sistojèn yo disponib [6]. Nan 2007, Takahashi et al.[Z avèk siksè repwograme selil somatik nan selil pluripotent ak pwopriyete anbriyonik, nonmen yo "pwovoke selil tij plus"(iPSCs). Depi lè sa a, anpil sous selil somatik yo te repwograme nan iPSCs (pwovoke selil tij plus) soti nan swa bèt oswa tisi imen (hiPSCs)[Z], ak fibroblas granmoaj ki reprezante sous prensipal la nan lèt la. Nan 2013, Freedman et al.[8] pwovoke hiPSCs (pwovoke selil tij plus) soti nan fibroblasts yo nan ADPKD (otosomal dominan politikaladi ren) pasyan yo epi yo te jwenn diminye ekspresyon politik nan politik-2, sipòte itilize nan selil sa yo mennen ankèt sou maladi politik (PKD). Plis dènyèman, Chen et al rapòte nan 2016 ke yo te jwenn selil hiPS soti nan selil pwojenitè eritwoyid [9].

Pandan dènye ane ki sot pase yo, te gen pwogrè enpòtan nan jenerasyon an nan òganik 3-dimansyon soti nan iPSCs (induit selil pluripotent tij) [Z,10-12]. PwensipalRenÒganoyid epidemi an ka sòti nan tisi ren, osi byen ke soti nan pipi, ak òganik sa yo se yon zouti enpòtan pou modèl maladi pèsonalize, jan yo montre pa Schutgens et al. [13]. Nan etid ki vin apre yo, Freedman et al.[14] te kapab jenereRenòganoyid ki sòti nan yon liy selil komèsyal ki disponib, etabli yon pwotokòl pou jenere kalite selil yo prezan nan mas meta-nefrik ki bay monte nan tout estrikti nan neveron an. Lè sa a, pa frape desann PKD1 la (kalite 1 politikRenmaladi) oswa PKD2 (kalite 2 maladi politik ren) jèn, envestigatè sa yo obsève fòmasyon sibsèks soti nanRenpwoblèm. Nan gade nan tout teknoloji sa yo avanse ak inovatè, nou vize jwenn iPSCs (pwovoke selil tij pluripot) soti nan selil yo eritwoyid sikile nan ADPKD (Otosomal dominan politikaladi ren)pasyan yo ak tès devlopman nan òganizasyon ren nan vitro repouse etap sa yo ki enplike nan òganik, ap eseye evoke kèk evènman patojèn ki gen rapò ak sistojèn bonè.

Klike sou efè segondè sispann ak benefis pou ren

Metòd pasyan seleksyon

Echantiyon san yo te ranmase nan de pasyan ki pa gen rapò (PT1 ak PT2) klinikman dyagnostike ak ADPKD (Otosomal dominan politik ren) (PT1:66 ane fin vye granmoun, eGFR 43.8 mL / min pou chak 1.73 m2 ak PT2:56years fin vye granmoun, eGFR 60.2 mL / min pou chak 1.73 m2), ki te swiv moute nan Maladi Ren Politik la. Klinik pasyan ekstèn nan Divizyon Nephroloji nan Inivèsite Federal Sao Paulo (UNIFESP) ak yon lòt echantiyon te ranmase nan yon fi ki an sante, ki te sèvi kòm yon kontwòl pou estabilize ak nòmalize teknik la. ADPKD (maladi politik dominan) dyagnostik te baze sou istwa fanmi pozitif ak sou prezans nan sibstans ren, dapre kritè yo ultrasonografik dyagnostik pa Pei et al[15]. (Fanmi pedigrees yo prezante nan S1A Fig). Tou de pasyan yo te gen ren sistik ak fwa (Imaj Rezònman Mayetik yo prezante nan S1B Fig). Etid la te revize ak apwouve pa Komite Konsiltatif Etik nan Inivèsite a (CEP UNIFESP, "Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo", Nr.1199.-0079-10/2018). Apre yon entèvyou pou eksplike objektif etid la, tou de pasyan yo ak kontwòl ki an sante te siyen fòm konsantman an enfòme.

Ekspansyon nan selil pwojektè eritwoyid izole soti nan tout echantiyon san yo te ranmase nan yon tib vaksen ki gen EDTA (kòm yon anticoagulant) nan tanperati chanm. Selil eritwoyid (EP) yo te Separe atravè yon metòd RosetteSep (15216; Teknoloji Stem Cell), ki retire selil vle, tankou matirite RBC ak plak pandan y ap kenbe popilasyon an EP vle. Akòz konsantrasyon ki ba nan EPS nan san antye, selil yo te elaji ak kiltire nan yon mwayen kilti espesifik ki gen cytokines ak sipleman (X-Vivo mwayen, Lonza). Selil EP yo te idantifye pa sitometri koule lè l sèvi avèk reseptè transfè a (CD71) ak glycophin A (Gly A)kòm makè ki make ak GFP (S2 Fig).

Reprograme selil pwojektè eritwoyid

Elaji selil EP yo te ranmase ak nikleyè lè l sèvi avèk yon iPSC episomal (induit selil tij plupots) Reprogram-ming twous (Thermo Fisher). Transfeksyon (elektwoporasyon), li te fèt ak vektè episomal (viris-gratis, nonn) ki soti nan yon twous faktè Lonza Nucleo. Apre transfeksyon, selil yo te plake nan ReproTeSR-espesifik mwayen kilti pou repwograme (Teknoloji Selil Stem) anba kondisyon kilti selil estanda (37C,95% CO, ak 5% O,).

Karyotype

Pou verifye si pwosesis la repwograme konsève entegrite kwomozòm, analiz karyotype te pote soti nan Depatman Jenetik la nan DEPATMAN Jenetik la nan CellsP.Cells yo te trete ak 100 μl nan kokiy (0.08ug / ml) nan 5 mililit selil kilti iPS pou endike arestasyon selil, ki te swiv pa adisyon a nan yon solisyon 0.075 M hypotonic KCL pou pwovoke anflamasyon nikleyè; Selil yo te Lè sa a, fiks ak yon melanj de melanj ak asid asid (3:1). Kwomozòm metaphase yo te rekòlte, ak tach Wright te itilize pou analiz sitojèn nan G-bann (S3 Fig).

iPSC (induit selil pluripotent tij) karakterizasyon koloni

Selil EP yo te repwograme pa vektè episomal ki te fòme iPSC (pwovoke selil tij plupotent) koloni yo ak prezante yon karyotype nòmal (S3 Fig). IPSC a (induit selil tij plus) karakteristik koloni yo te konpare ak sa yo ki nan yon kontwòl etabli sòti nan selil a H9 (hESC, Selil imen anbryonik, WA09, ki disponib nan Enstiti Rechèch Wicell, USA). Depi iPSC yo (pwovoke selil tij plus) prezante mòfoloji tipik, makè yo plus yo te idantifye pa iminofluoresans. Selil yo te fiks ak 4% parafòmaldedyid pou 30min nan tanperati chanm. Apre fikse, echantiyon yo te lave ak PBS twa fwa, bloke nan 5% PSA ak 0.3% Triton-X-100 / DPBS, ak incubated lannwit lan ak antikò prensipal (Siyal selilè, Ma, EUA), sètadi, OCT4 (1: 400 dilisyon) kòm yon tès nan pluture. Nan demen, yo te prepare yon nouvo glise, lave nan PBS, ak incubated ak yon antikò segondè Alexa Fluor (1:200 dilisyon, Siyal selilè), ak DAPI (1:1000, Envitwojèn, MA, USA)te ajoute pou idantifikasyon nikleyè.

Fig 1. Jenerasyon ak karakterizasyon nan iPSCs(pwovoke selil tij plupotent). iPSC yo te repwograme soti nan pwojè elaji pwojektè eritwoyid (EP) selil ki soti nan yon kontwòl ki an sante (HC) ak de diferan pasyan ADPKD (PT1 ak PT2).

A. Schematic jenerasyon etap nan ren òganoyid B. Simularity nan iPSC (a. tipik imaj nan iPSC soti nan selil yo komèsyal H9 anbriyon. b. iPSC soti nan selil eritwoyid pwojenitè soti nan kontwòl la an sante)

C. Morphology nan koloni iPSC D. Karakterizasyon nan iPSC pluripotency obsève anba yon eVOS fl envèse mikwoskòp dijital.

OCT4 antikò etikèt yo te itilize kòm yon makè plus pou karakterize nati a pluripotency nan HC a, PT1, ak koloni PT2.

Selil nikleyè yo te make ak DAPI (ba echèl pou Fig 1B: 200 μm; echèl ba pou Fig 1C: 1000 μm; echèl ba HC / PT2 pou Fig 1D:1000 μm; echèl ba PT1 pou Fig 1D: 200μm).

Kapasite iPSCs (pwovoke selil tij plutent) diferansye nan tout twa kouch jèm

iPSCs (induit selil tij plus) yo te grandi nan 6-byen plak ki te kouvwi ak Matrigel (1:10,BD Biyosciences, NY, EUA)nan mwayen kilti mTeSR1 (Teknoloji Selil, BC, Kanada). Pou anpeche iPSC yo (pwovoke selil tij plutent) soti nan diferan, koloni yo te pasaje manyèlman pa fragman mekanik ak yon tip tiyo anba yon mikwoskòp, oswa yo te desosye pa dijesyon anzimatik lè l sèvi avèk Selil Lavi (Teknoloji Lavi) (S4 Fig). Sèvi ak metòd sa yo, iPSCs (pwovoke selil tij plutt) yo te konsève pou 22 seri pas-sages asire ke selil yo byen enkòpore faktè yo repwograme. IPSC yo (induit selil tij plutent) yo te Lè sa a, ankouraje yo diferansye nan twa kouch yo jèm lè l sèvi avèk yon twous STEMdiff Trieage Diferansyasyon (Stem Teknoloji Selil). Apre senk jou, selil yo te rekòlte pou analiz de makè liy-espesifik nan mesoderm ak andoderm, epi apre sèt jou yo te analize pou ekolojik, dapre pwotokòl la STEMdiff Trieage Diferansyasyon (S5 Fig).

Karakterizasyon molekilè nan tout twa liy jèm pa qRT-PCR

Total RNA soti nan kilti twa kouch jèm yo te ekstrè lè l sèvi avèk yon twous GE RNA Spin Mini (GE Healthcare, USA), ak Lè sa a, konvèti nan CDNA lè l sèvi avèk yon Kapasite Ranvèse Segondè Kit (Aplike Biostems, USA)dapre enstriksyon manifakti a. Quantitative an tan reyèl PCR (gRT-PCR) te pote soti lè l sèvi avèk yon twous SYBR Green PCR (Aplike Biostems, USA) dapre nivo ekspresyon manifakti a.mRNA nivo ekspresyon yo te kalkile lè l sèvi avèk 2^Ct metòd la. Hydroxymethylbilane sentet (HMBS) ak glisehyde 3-phosphate dezidrogenase (GAPDH) yo te itilize kòm kontwòl entèn, ak ekspresyon an nan OCT4 te itilize kòm yon kontwòl quantitative. Ekspresyon an nan SOX17 te itilize yo idantifye diferansyasyon nan andoderm, CXCR4 te itilize yo idantifye diferansyasyon nan mezoderm la, ak PAX6 te itilize yo idantifye diferansyasyon nan ekoderm (S6 Fig). Tout sekans prensipal yo espesifye nan tab S1, ak koub la efikasite te evalye pou chak pè prensipal.

Immunofluorescence pou kouch yo diferan jèm

iPSCs (induit selil tij plutent) yo te pwovoke diferansye sou kouvri nan sis-byen plak. Apre diferansyasyon, kouvèti yo te retire nan byen orijinal yo ak transfere nan yon nouvo plak, kote selil yo te fiks ak 4% parafòmaldehyde ak Lè sa a, lave ak PBS, jan sa dekri pi wo a. Prensipal antikò kont OCT4 (1:400; Siyal selil), CXCR4(1;100; Siyal selil), PAX6(1:100; Tèmo pechè), ak SOX17 (1:100; Yo te itilize R &a.. Fluoresans te evalye lè l sèvi avèk yon antikò segondè Alexa Fluor (1:200; Siyal selilè).

Diferansyasyon organoid soti nan iPSCs (induit selil tij pluripotent)

Renalorganoids yo te pwodwi apre pwotokòl la ki dekri pa Cruz et al. [6] ak kèk adaptasyon. Yon ti tan, 50,000 iPSCs (pwovoke selil tij plus) soti nan HCand de ADPKD (Autosomal dominan politik maladi ren) yo te itilize yo pwodwi sispansyon nan selil sèl ak solisyon detachman Accutase (Stem Cell Teknoloji). Selil sèl yo te konplete ak 10uM Rho-kinase inibitè (Y27632, Teknoloji Selil Tij oswa Stemgent). Apre 16 h, mwayen kilti a te ranplase ak 1 mL nan mTeSR1 +2.5%Matrigel +10 μuM Y27632. Apre 20h, mwayen an te ranplase ak 1mL nanTeSRI sèlman;14 h pita, mwayen kilti a te ranplase, ak selil yo te pwovoke ak 6 UM CHIR99021 (AT104; Selil tij oswa Stemgent GSK-3b inhibitor/Wnt chemen agonistan)+Avanse RPMI (Thermo Fisher)+ Glutamax (Teknoloji Lavi)+ 10 ug / ml antibyotik (Ampicillin; 1:1000; Gibco). Finalman, 36 h pita, mwayen kilti a te ranplase ak DRB mwayen ki gen RPMI Avanse (Thermo Fischer)+ Glutamax (Thermo Fischer)+ B27 Sipleman (17504-044; Teknoloji lavi)+ antibyotik. Yo chanje mwayen DRB a chanje chak twa jou pou 28 jou. Peryòd sa a (28 jou) te ase pou òganoyid yo dwe vizib pa mikwoskòp.

Karakterizasyon molekilè nan òganizasyon pa RT-PCR

Ekspresyon jenetik semi-quantitative te evalye pa RT-PCR pandan pwosesis anbriyon an ak total RNA ke yo te pirifye nan estrikti selil ki te fòme nan jou 0 (iPSCs (pwovoke selil tij plupot)) ak nan 14,21, 28, ak 35 jou apre endiksyon diferansyasyon. Ekspresyon an nan WT1 (devlope ren), AQP1 (tib pwoksimite), ak ECAD (makè sistematik) te evalye. GAPDH te itilize kòm yon kontwòl entèn. Ekspresyon an nan OCT4 te itilize kòm yon estanda quantitative.

Rezilta

Jwenn iPSCs (induit selil tij pluripotent) soti nan pwojenitè eritwoyid (EPS)

Pwotokòl la te anplwaye pou jwenn òganizasyon ren ki soti nan pwojè eritwoyid yo rezime. EPS ekspansyon te lakòz nan 1x10 ° selil apre apeprè 20 jou (S2A Fig), ak apeprè de mwa pita, EPS yo te idantifye pa ekspresyon yo nan makè yo CD71 ak Gly A. Efikasite nan metòd separasyon an revele ekspresyon;88% nan selil yo te CD71 pozitif, ak 57,4% yo te Gly Yon pozitif (S2BFig).

Apre verifye ke selil yo te EPS, yo te transfekte ak faktè repwograme (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc, ak klf4) ak Lè sa a, yo te kenbe nan yon mwayen espesifik pou repwograme (ReproteSR, Stem Cell Teknoloji) pou apeprè senk jou. iPSCs (induit selil tij plupotent) devlope karakteristik selilè tipik pa fòme koloni yo ak yon mòfoloji distenk soti nan sa yo ki pa repwograme prezan nan menm kilti a. Selil yo te kontwole jiskaske nou obsève iPSC (pwovoke selil tij plus) -tankou koloni ki te sanble ak koloni yo nan liy selil komèsyal H9 (Eig 1B).iPSC (pwovoke selil tij plus) yo te tou rekonèt pa gwosè relativman pi gwo, selil pake-ing, ki byen defini fòm omojèn, ak bor regilye. Idantifikasyon te fasilite pa degre ki ba nan koloni ranvèse soti nan selil diferansye nan yon mwayen repwograme federal (Eig 1C). Pa gen okenn diferans detektif yo te jwenn nan mitan koloni iPSC ki soti nan HC a ak ADPKD (Otosomal dominan politik maladi ren) pasyan (PTL ak PT2) an tèm de mòfoloji koloni ak makè plupotans, jan yo montre nan Fig 1D.

iPSCs (induit selil tij plus) yo te plis karakterize pa kapasite yo diferansye nan twa kouch yo jèm. Imaj tipik nan pwogresyon an nan devlopman kouch jèm nan selil ki soti nan HC a yo montre nan S5 Fig. Devlopman nan twa kouch yo jèm te verifye pa mòfoloji tipik (Eig 2A) ak pa immunofluoresans etikèt pou makè diferansyasyon, sètadi, FOXA2 pou ando-derm, actin nan misk lis (SMA) pou mesoderm ak SOX2 pou ekolojik (Eig2B-2D). Kontwòl negatif pou antikò yo montre nan S7 Fig. Fig 2E montre nivo yo ekspresyon jenetik nan makè espesifik nan endoderm (SOX17), mesoderm (CXCR4), ak ekoderm (PAX6), jan sa detekte pa RT-PCR.

Fig 2. Karakterizasyon nan twa kouch mikwòb yo. Kontwòl sante (HC) ak pasyan ADPKD1 (PT1 ak PT2).

A. Mòfoloji tipik nan twa kouch mikwòb yo. Kouch jèm yo te karakterize pa iminofluoresans tach lè l sèvi avèk antikò espesifik. B. Endoderm (FOXA2),

C. Mesoderm (α SMA) ak D. Ectoderm (SOX2). Yo te tache ak DAPI. Kolòn dènye yo montre imaj fizyon.

E. Jenèz ekspresyon nan OCT4 endike pluripotenment nan iPSCs, SOX17 te yon makè pou andoderm, CXCR4 te yon makè pou mezoderm ak PAX6 te yon makè pou ekoderm (n = 2).

Ekspresyon OCT4 pa iPSCs te itilize kòm yon kontwòl quantitative entèn. Ekspresyon OCT4 te endetektab nan selil yo nan twa kouch yo jèm (echèl: 200 μm).

Jenerasyon nan òganizasyon ren soti nan iPSCs (induit selil tij plutent)

Estrikti ren ki dimansyon yo te pwodwi soti nan iPSCs (pwovoke selil tij plutive) sòti nan HC a ak tou de ADPKD (Otosomal dominan maladi ren) pasyan sa yo ki repouse etap sa yo ki repouse devlopman anbriyon. Fig 3 montre etap sa yo ki nesesè pou jwenn estrikti yo respektif anbriyon. iPSC (induit selil tij plus) (Eig 3A) yo te desokri ak Akizatè (Fig 3B)pou jwenn sèl iPSCs (induit selil tij plus) (Fig3C). Lè ou konsidere pwosesis la nòmal anbriyon, koloni yo ta dwe espere diferansye nan yon eksplozyon ak Lè sa a, yon gastrula, men diferans lan espontane nan iPSCs (pwovoke selil plus) nan kilti se toujou yon defi depi selil espontaneman sibi apoptosis [16]. Pou kontourne rezilta sa a san parèy, yon inibitè ROCK nan siyal (10μM Rho-kinase inibitè Y27632) te ajoute 16 h apre etap nan yon sèl-selil. Anpèchman nan wout la ROCK anpeche selil yo soti nan deklanche chemen yo lanmò, ki pèmèt yo siviv ak ajiste nan direksyon pou pwosesis la diferansyasyon. IPSC yo (induit selil tij plupotent) Lè sa a, te grandi jiskaske rive nan etap nan epidemi, ki karakterize pa prezans nan kavite esfè (Fig 3D). Apre sa, yon potansyèl GSK-3b inibitè / Wnt chemen agonist (CHIR99021) te ajoute, ki te swiv pa adisyon a nan mwayen DRB pou pwovoke tranzisyon epidemi mesenchymal (Fig 3E ak 3E) epi finalman mesaje tranzisyon epidemi (Fig 3G); etap sa yo pèmèt epithelialization ak fòmasyon sekans nan pre-tib ak dechay ren (Eig 3H), ki finalman pèmèt fòmasyon an nan òganois ren (Fig 3D). Tout bagay sa yo nan etap anbriyon vitro yo te menm jan an pou selil ki sòti nan tou de HCand ADPKD (Otosomal dominan maladi politik ren) pasyan yo.

Prezans nan estrikti tibilè te verifye pa ekspresyon an nan makè espesifik pa iminofluoresans: NHE3 ak AQP1 pou tib pwoksimite (Eig4A)ak NPHS2 pou gloriye (Eig 4B). Nan contrast, AQP2 etikèt pa te detekte (Eig 4B), ki konfime ke metodoloji sa a pèmèt sèlman devlopman nan mas metanefrik la, men se pa nan boujon an tèmik. Makè ECAD la pa te detekte nan absans la nan forskolin (Fig 4B).

Pou verifye prezans makè espesifik eksprime nan tout pwosesis la nan devlopman ren pwojenitè, tout echantiyon (HC, PT1, ak PT2) yo te ranmase nan senk pwen nan pwosesis la tout antye nan diferans: jou 0 (iPSCs (induit selil tij plutent), jou 14,21,28, ak Lè sa a, nan jou 35 (7 jou apre endiksyon sibstans). Kou a tan nan ekspresyon jèn revele diferansyasyon pandan pwosesis anbriyon an, jan yo montre nan Fig 5A-5C. Makè a plupoten oct4 te eksprime pa iPSCs (jou O), men nivo li yo te redwi sou 14 jou, rive nan nivo trè ba apre diferansyasyon. Nan contrast, ekspresyon an nan makè yo espesifik nan metanefrik metanefrik (WT1) ak pwoblèm pwoksimal (AQP1) pwogresivman ogmante lè pwosesis la diferan te inisye pa jou 14, rive nan yon plato pa jou 21. Fig 5D montre ekspresyon an nan ECAD, yon makè sistojèn, nan jou 35,sa sa se egzanp 7 jou apre endiksyon sispansyon pa forskolin. Nan absans la nan forskolin, ekspresyon an nan ECAD te trè ba, menm nan ADPKD (Otosomal dominan politik maladi ren) pasyan yo. Sepandan, lè forskolin te ajoute (jou 28), tou de pasyan yo eksite ogmante ekspresyon ECAD; men menm modèl la pa te obsève nan òganoid HC ki te rete ak nivo ki ba nan ECADexpression menm nan prezans nan forskolin.

Prezans nan absè ki te fòme soti nan òganoyid yo ankouraje ak forskolin te evidan pou ADPKD (Otosomal dominan politik maladi ren) pasyan yo, jan yo montre nan Eig6. Panèl la anwo montre imaj nan òganis yo nan jou 28, anvan adisyon a nan forskolin (Eig6Aa). Eig6Ab (panoramic view-4X) ak 6Ac (20X gade-ing) montre òganois yo nan jou 35 nan prezans nan forskolin ki montre prezans nan estrikti siste-tankou nan echantiyon soti nan tou de pasyan (PT1 ak PT2), men se pa nan echantiyon an HC. Prezans nan absè te tou verifye pa iminofluoresans tach (Fig 6B). ECAD etikèt pa te detekte nan òganik HC a, men li te klèman obsève nan òganois yo soti nan tou de pasyan yo. Enteresan, prezans nan yon limyè absè kapab tou obsève.

Fig 3. Jenerasyon òganizasyon tibèkiloz.

Faz-kontras imaj nan jenerasyon an nan epidemi tibilè ren nan 28 jou soti nan iPSC ki te pwodwi soti nan HC a, PT1, ak PT2 gwoup. Nan premye 36 h, iPSC yo te konsève nan kilti 3D.

Lè sa a, yo te desociive, transfòme nan selil sèl, ak trete ak Y-27632, ki pèmèt reòganizasyon selilè ak siviv, pwodwi esfè epidemi (d).

Lè sa a, CHIR99201 ak DRB te ajoute, aktive Wnt / β-katenin chemen an ak pèmèt diferansyasyon nan òganik tibilè (I).

Mòfoloji a nan mitan esfè sòti nan pasyan ADPKD ak nan yon donatè HC se menm jan an. (Echèl ba pou yon ak f: 1000μm; echèl ba pou b, c d, e, g, h ak i: 200μm).

KLIKE LA A POU PATIII.