Endiksyon nan iminite periferik ki fòme nan pankreyas la ankouraje aktivite anti-timè pou kontwole pwogresyon kansè nan pankreyas Pati 2

Diskisyon

Pandan ke yo te deja karakterize trafik nan -glucan, twopim espesifik nan -glucan nan pankreyas la pa te deja rapòte37. Nou montre ke patikil -glucan ka fè trafik dirèkteman nan pankreyas la epi yo ka tou fagocytosed pa makrofaj ki Lè sa a, trafik nan pankreyas la. Relasyon ki genyen ant kavite peritoneal la ak pankreyas la pa te byen defini, ak etid ki gen rapò ak fizyopatoloji pankreatit egi (AP) te idantifye ke macrophages peritoneal yo se yon kontribitè prensipal nan repons enflamatwa nan AP, kidonk sipòte yon koneksyon ant peritoneum la. ak pankreyas la38.

Done D nou yo tout bon montre ke makrofaj peritoneal ki fagositòz izotòp ki make WGP prensipalman trafik nan pankreyas la. Etid sou blesi fwa te sipòte plis modèl sa a nan yon echanj dinamik nan selil ant kavite peritoneal la ak ògàn solid ki endepandan de sikilasyon an 39. Ansanm sa a sijere ke menm nan kondisyon omeyostatik gen egziste yon nivo fondamantal nan echanj selil iminitè ant pankreyas la. ak kavite peritoneal ki ka eksplwate nan anviwònman an nan patikil -glucan.

Makwofaj yo se yon pati enpòtan nan sistèm iminitè natirèl kò imen an epi yo gen fonksyon pwisan pou idantifye, fagozit, ak retire bakteri ak sibstans etranje. Parodontit, yon maladi kwonik enfektye ki karakterize pa enflamasyon gingival ak pèt zo alveolè, se kòz prensipal pèt dan nan granmoun. Kounye a li klè ke destriksyon tisi nan parodontit ki te koze pa repons iminitè lame a nan enfeksyon, ak makrofaj, kòm yon pati enpòtan nan repons iminitè lame a, jwe yon wòl enpòtan nan ensidan an ak devlopman nan enflamasyon.

Se poutèt sa, nou bezwen amelyore iminite nan lavi chak jou nou an. Nan rechèch nou an, nou te jwenn ke Cistanche ka amelyore iminite. Ajoute Cistanche nan dlo bouyi pou fè te Cistanche, epi bwè li 1-2 fwa pa jou ka amelyore fonksyon iminitè a nan kò a paske li gen engredyan aktif, tankou polisakarid, flavonoid, alkaloid, elatriye, ki ka amelyore. fonksyon iminitè nan kò a. An menm tan an, ajoute Cistanche nan soup oswa labouyl, yon fwa oswa de fwa pa semèn ka amelyore iminite.

Klike pou konnen pi bon kalite pwodwi cistanche

Pandan ke etid sa a te mennen ankèt sou patikil -glucan WGP, li ka enteresan tou pou envestige si idrosolubl -glucan ki sòti nan ledven montre yon tropism menm jan an ak mekanis siyal nan pankreyas la. Yo konnen patikil -glukan yo siyal dirèkteman atravè Dectin-1, pandan y ap panse ke -glukan idrosolubl yo fonksyone atravè yon chemen depandan CR3-pou egzèse pwopriyete anti-timè yo40,41. Yon etid te montre ke IP administrasyon idrosolubl -glucan te lakòz trafik nan san periferik la ak APC nan peritoneum, larat, ak mwèl zo a, ki endike ke malgre diferan mekanis siyal molekilè yo, yon kapasite menm jan an aktive iminite ki antrene ka posib42. Sepandan, kòm done nou yo endike ke trafik sa a depann de Dectin-1, sèlman patikil -glukan ki ka montre trafik dirèk nan pankreyas la atravè patikil ak soluble ka inisye mekanis iminite fòmasyon.

Anplis de sa, etid anvan yo ki karakterize trafik la nan enjekte nan venn idrosolubl -glucan montre trafik nan larat, ren, ak fwa menm si pa mansyone twopim nan pankreyas la43. Kòm pankreyas la pa te deja panse kòm yon sib nan trafik -glucan li pa klè si pankreyas la tou senpleman pa janm te etidye oswa si trafik pankreyas pa rive.

Etid nan lavni ta dwe adrese byodistribisyon nan tou de soluble ak patikil -glucan atravè divès wout administrasyon.

-Trafik glikan nan pankreyas la gen yon enpak miltifaktè sou popilasyon iminitè ki prezan nan pankreyas la. Premyèman, arive glukan nan pankreyas la afekte dirèkteman popilasyon makwofaj rezidan M2 imunosuppressive ki prezan nan pankreyas la ke yo konnen yo enpòtan nan pwomosyon timè pankreyas yo. Done CyTOF ak scRNA-Seq te montre yon disparisyon prèske nèt sou tout pwen nan popilasyon rezidan makrofaj la 7 jou apre administrasyon WGP. Enteresan, disparisyon nan popilasyon an macrophage rezidan kowenside dirèkteman ak yon aparans resipwòk nan yon popilasyon Ly6Clo macrophage. Popilasyon makrofaj Ly6Clo sa a gen mak fenotip ki sanble ak popilasyon rezidan an, menm si li plis nan direksyon pou yon fenotip M1.

Se konsa, li posib ke macrophages rezidan yo vin an kontak ak -glucan ki te trafike nan pankreyas la ak selil sa yo vin repolarize, kidonk pran yon fenotip selilè diferan ki rezilta nan fòmasyon nan yon grap inik. Dezyèmman, rive nan -glucan nan pankreyas rezilta yo nan siyal reseptè chemokine/chemokine anplifye ki rekrite pro-enflamatwa Ly6CHi enfiltre macrophages ki sòti nan monosit soti nan periferik nan pankreyas la. Vennkat èdtan apre administrasyon WGP, yo jwenn nivo CCL2 nan lisat pankreyas yo ogmante pa 30-pliye. An konsekans, nou montre ke gaya -glucan depandan foul selilè nan pankreyas la depann sou CCR2.

Pandan ke nou konsantre sou dinamik yo nan lòj la myeloid akòz enpòtans yo obsève nan siyal CCR2 / CCL2, te gen yon amelyorasyon premye enteresan nan gwoup 11 nan jou 3 ak Lè sa a, disparisyon nan jou 7 apre tretman WGP. Gwoup 11 te karakterize kòm ILC2s ki baze sou ekspresyon plizyè makè tankou KLRG1, IL-5, IL-13, ak ICOS. Yo konnen ILC2 yo se selil ki rezidan tisi alontèm44. Dènye etid yo te montre ke deklanchman ILC2 lokal pa alarmin espesifik tisi pwovoke pwopagasyon yo, migrasyon ne lenfatik yo, ak difizyon san. ILC2 ki soti nan plizyè tisi, tankou zantray la ak nan poumon, yo te montre yo antre nan san an pa extrusion soti nan tisi sa yo perturbe ak imigre nan lòt tisi tankou fwa a44-46.

Yon mekanis konsa ka eksplike ogmantasyon inisyal la ak Lè sa a, disparisyon nan ILC2s nan pankreyas la. Etandone ke ILC2 yo dènyèman te enplike nan repons timè pankreyas la nan imunoterapi47, gen plis rechèch ki jistifye ki mennen ankèt sou enpak WGP ak inisyasyon iminite fòmasyon sou popilasyon ILC2 nan pankreyas la.

Malgre ke inisyasyon yon foul de selil iminitè pro-enflamatwa nan pankreyas la enpòtan nan tèt li, li se CCR2 plis Ly6CHi ki enfiltre popilasyon macrophage ki sòti nan monosit ki soti nan periferik montre karakteristik iminite ki antrene ki pote enplikasyon ki pi enpòtan yo kòm endiksyon nan. iminite periferik antrene nan pankreyas la poko te karakterize. Iminite antrene pwovoke sa a asosye tou ak repwogram metabolik ak epigenetik.

Pandan ke CCR2 se li te ye yo dwe yon reseptè enpòtan nan rekritman nan monosit, sa a se tou premye endikasyon ke siyal CCR2 sou monosit se nesesè pou etablisman an nan iminite periferik ki resevwa fòmasyon. Li te note ke CCR2 plis monosit / makrofaj yo te lye nan metastaz timè ak pwogresyon48,49. Sepandan, done nou yo sijere ke rekritman nan repwograme, antrene CCR2 plis monosit / makrofaj egzèse gaya efè anti-timè.

Sa a se dirèkteman demontre pa eksperyans admix nou an kote sourit ki te resevwa CCR2 plis selil myeloid soti nan sourit ki antrene WGP te montre yon fado timè siyifikativman redwi an konparezon ak sourit ki te resevwa selil CCR2- myeloid soti nan sourit la menm antrene.

Kòm nou montre ke yo te etabli iminite periferik antrene nan pankreyas la, nou mande si selil sa yo ta ka reyaktive pa selil timè oswa faktè sekrete yo. Yo te montre re-ekspozisyon selil pankreyas pankreyas in vivo ki antrene WGP nan medya ki gen timè kondisyone pou yo bay kouray yon repons ki antrene. Kalafati et al. dènyèman te montre yon wòl pou granulosit nan mekanis anti-timè ki baze sou iminite21, sepandan, dapre itilizasyon modèl kansè lar yo, etid yo rapòte kounye a se premye egzanp ki sijere ke selil myeloid nan yon ògàn espesifik ka resevwa fòmasyon pou reyaji dirèkteman nan selil timè nan menm ògàn sa a.

Li te byen etabli ke selil myeloid yo kapab dirèkteman touye selil timè yo atravè mekanis fagositoz ak pwodiksyon ROS50-54, epi isit la nou montre ke fòmasyon WGP siyifikativman ogmante fonksyonalite dirèk anti-timè nan fagositoz amelyore nan selil timè ak ROSmedyati cytotoxicity. selil timè yo.

Pli lwen, pandan ke nou mete aksan sou ke medya ki gen timè-kondisyone ka reaktive selil myeloid ki antrene, nou menm tou nou idantifye yon faktè espesifik, MIF, nan medya yo ki gen timè-kondisyone ki enplike nan aktivasyon sa a. Done sa yo sijere ke endiksyon an nan iminite ki resevwa fòmasyon ta ka patisipe nan mekanis nan imunosveyans timè. Pou egzanp, nan premye etap yo nan devlopman timè, timè sekrete faktè idrosolubl ki ka re-estimile selil natirèl ki fòme ki mennen nan eradikasyon nan selil timè sa yo.

Lè sa a, nou tradui konpreyansyon sa a sou potansyèl anti-timè selil myeloid natirèl ki antrene nan pankreyas la nan modèl ortotopik PDAC, kote nou obsève yon diminisyon dramatik nan fado timè a ak yon ogmantasyon nan siviv sourit yo bay yon sèl administrasyon nan. WGP. Nou plis demontre ke selil ki responsab pou kontwòl timè yo sitou antrene CCR2 plis selil ki sòti myeloid. Kontrèman ak lòt modèl kontwòl timè yo pwopoze yo ki parèt antyèman kondwi pa endiksyon iminite santralman antrene nan BM21 a, olye de sa, nan modèl sa a byen bonè trafik WGP nan pankreyas la ak pwodiksyon an ki kapab lakòz CCL2 nan pankreyas rekrite ki resevwa fòmasyon. CCR2 plis selil myeloid ki soti nan periferik ki responsab prensipalman efè anti-timè yo. WGP trafik dirèkteman nan pankreyas la tou repolarize M2-macrophages rezidan tisi yo nan direksyon pou M1-mawofaj tankou M1-ki ka anpeche pwogresyon timè tou.

Pandan ke rediksyon timè yo obsève nan sourit implanté ak timè KPC ki te melanje ak CCR2 plis selil ki antrene te enpòtan, li pa t 'tankou frape tankou sou sourit yo bay IP WGP. Sa a sipòte ke efè anti-timè nan IP WGP yo doub; rekritman nan CCR2 plis fòme selil myeloid anti-timè nan pankreyas la ak repolarizasyon nan macrophages rezidan pro-tumorigenic travay an konsè pou pwovoke repons natirèl anti-timè ki mennen nan redwi fado timè nan modèl PDAC.

Nou remake tou ekspresyon segondè MHCII sou monosit / makrofaj ki resevwa fòmasyon sa yo, ki gen anpil chans jwe yon wòl nan pwosesis antijèn timè ak kominikasyon ak selil T pou pwovoke repons iminitè adaptatif kont timè a. Enteresan, pandan ke nou konfime ke mekanis anti-timè sa yo pa depann de repons iminitè adaptasyon, nou te obsève yon ogmantasyon enpòtan nan CD8 plis selil T ki prezan nan CCR2 plis timè melanje. Anplis de sa, bay selil myeloid nan timè yo te obsève yo montre nivo segondè nan PD-L1 ak ke prezans nan ki antrene CCR2 plis selil nan pankreyas la te parèt yo rekrite CD8 plis T-selil, nou te rezone ke WGP ka potansye efè anti. -PD-L1 terapi.

Dapre literati a, terapi anti-PD-L1 mAb pou kont li pa te gen okenn benefis siviv pandan y ap konbinezon an nan WGP ak anti-PD-L1 synergized pou pwodwi pi bon rezilta siviv pase WGP pou kont li55. Sa a sijere ke selil iminitè natirèl ki fòme yo ka aktive selil iminitè adaptatif nan TME a, sepandan, mikwo-anviwònman iminitè a gen anpil chans bezwen plis simonte pa efè yo konkomite nan anti-PD-L1. Sa ki enpòtan, malgre siviv amelyore, tout sourit te evantyèlman mourir nan timè a, kidonk envestigasyon nan lavni nan optimize tretman sa a an tèm de dòz ak kantite tretman yo jistifye.

Selil myeloid imunosuppressive jwe yon wòl enpòtan nan kreyasyon TME imunosuppressive nan PDAC. Isit la, nou demontre yon kapasite pou angaje selil myeloid sa yo nan anviwònman PDAC atravè endiksyon iminite natirèl ki fòme nan pankreyas la.

Sa ki enpòtan, nou montre tou ke kapasite nan kòmanse iminite ki resevwa fòmasyon nan pankreyas la potansye efè yo terapetik nan imunoterapi tankou anti-PD-L1 imuno-checkpoint terapi blokaj. Prete plis aplikasyon klinik nan konklizyon sa yo, nou montre tou ke endiksyon an nan iminite ki antrene nan anviwònman an adjuvant ka diminye gwosè timè ak pwolonje siviv. Konklizyon sa yo mete aksan sou potansyèl pou itilize -glucan pou vize selil myeloid ki nan TME a epi mete aksan sou ke endiksyon iminite periferik antrene nan pankreyas la ta ka jwe yon wòl konsekan nan repwogram TME suppressive nan PDAC ki ka lakòz pwolonje lavi pasyan yo. dyagnostike ak maladi sa a ki ka touye moun.

Metòd

Deklarasyon etik.

Tout eksperyans ki enplike bèt yo te fèt dapre direktiv etik yo tabli pa Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilize Animal University of Louisville. Eksperyans yo te fèt dapre pwotokòl apwouve 19471 ak 19536.

Sourit.

Nan tout eksperyans yo te itilize sourit gason ak fi ki gen sis a uit semèn. Sourit sovaj (WT) C57BL/6 J yo te achte nan laboratwa Jackson (Bar Harbor, ME, USA) oswa elve nan etablisman bèt University of Louisville-espesifik patojèn (SPF). C57BL/6 Dectin-1 knockout (Dectin-1-/-) sourit yo te dekri deja56. Sourit knockout mondyal CCR2 yo te achte nan men Jackson Laboratory. Doktè Jonathan Warawa nan University of Louisville te bay sourit Albino C57BL/6. Yo te achte sourit NOD/SCID/IL2r Null (NSG) nan laboratwa Jackson. Gwosè timè maksimòm IUCAC te pèmèt pa plis pase 2000 mm3. Sourit yo te kontwole chak jou pou kwasans timè ak euthanized lè fado timè a depase gwosè limite a. Sourit yo te kenbe sou yon sik fènwa/limyè 12-h nan tanperati chanm ak imidite kontwole (apeprè 55 pousan).

Tout bèt yo te loje nan yon etablisman baryè epi sèlman sourit ki an sante yo te itilize pou eksperyans. Tout sourit yo te gen omwen 6 semèn sou nou, ak tout eksperyans ki enplike bèt yo te fèt an konfòmite ak tout lwa enpòtan ak direktiv enstitisyon yo bay nan Etablisman elvaj wonjè (RRF) ak apwouve pa Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal (IACUC). nan University of Louisville.

Preparasyon nan -glucan.

Trè pirifye patikil -glucan nan fòm patikil antye -glucan patikil (WGP) izole nan Saccharomyces cerevisiae te bay pa Biothera. Anvan w itilize, WGP te dousman sonike pou 15 s, de fwa lè l sèvi avèk yon Qsonica Q55-110 Q55 Sonicator (Cole-Parmer) pou asire total yo te kraze.

Preparasyon ak itilizasyon DTAF-WGP.

DTAF (Sigma-Aldrich) nan 2 mg / mL te melanje ak yon sispansyon nan 20 mg / mL WGP nan tanpon borat (pH 10.8). Sa a te enkube nan tanperati chanm pou 8 èdtan ak melanje kontinyèl. Apre enkubasyon, yo te santrifuje WGP a epi lave avèk DPBS esteril san endotoksin (Sigma-Aldrich) senk fwa oswa jiskaske supernatant la pa gen DTAF vizib ankò. Konsantrasyon an te ajiste a 10 mg / mL nan endotoxin-gratis DPBS pou depo. Apeprè 1 mg nan DTAF-WGP te enjekte IP nan C57BL/6 ak Dectin-1-/- sourit ak ògàn yo te rekòlte 3 jou apre.

Preparasyon 89Zr-WGP la.

WGP (100 mg) te melanje ak DeferoxamineSCN (2.7 mg, nan 0.8 ml DMSO) epi sispann nan 10 ml tanpon carbonate sodyòm (0.1 M, pH 9.4) lannwit lan. nan tanperati chanm nan fè nwa a ak souke dou. Lè sa a, te lave WGP a Deferoxamine ki make ak dlo DI (10 × 40 mL), epi 30 mg nan Deferoxamine ki make WGP te melanje ak 3 mCi nan 89Zr oksalat nan 2 ml Tris•HCl tanpon (0.5 M, pH 7.5), ak Lè sa a, enkube a 37 oC pou 60 min ak souke. Lè sa a, 89Zr-WGP te santrifuje epi lave ak 3 ml PBS esteril. Radyaktivite 89Zr-WGP te mezire pa yon kalibratè dòz epi yo itilize pou etid in vitro ak in vivo.

Byodistribisyon ak PET/CT eskanè lè l sèvi avèk 89Zr-WGP.

Tomografi emisyon positron (PET)/tomografi òdinatè (CT) te fèt nan sourit C57BL/6 ak Dectin-1-/- 48 èdtan apre piki IP 1 mg pi 89Zr-WGP oswa piki 1 × 106 peritoneal. makrofaj ki te ko-kilti ak 25 ug / ml 89Zr-WGP pou 2 èdtan ak Lè sa a, dousman lave yo retire depase 89Zr-WGP. Sourit yo te tcheke pou 15 minit ak yon Siemens R4 MicroPET ki te swiv pa 10 minit nan eskanè CT. Lojisyèl Siemens IAW yo te itilize pou akizisyon ak rekonstriksyon siyal PET la, epi yo te itilize lojisyèl Siemens IRW pou fusion ak analize done imaj yo.

Nan fen etid imaj la, sourit yo te euthanized, ak ògàn nan enterè yo te rekòlte. Pou byodistribisyon, yo te kolekte 50 uL san periferik lè l sèvi avèk yon teknik retro-bulbar senyen. Sèvo, kè, poumon, fwa, larat, ren, pankreyas, gwo trip, ti trip, lestomak, femoral, yon moso po ki soti nan flan sourit yo, ak misk rectus femoris yo te rekòlte, peze, epi mete yo nan yon 2470 Wizard otomatik Gamma counter (PerkinElmer) pou mezire radyoaktivite chak tisi. Valè CPM yo te kalkile lè l sèvi avèk lojisyèl Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Pwosesis pankreyas.

Apre euthanization, pankreyas sourit la te rekòlte ak dousman koupe an pi piti moso lè l sèvi avèk sizo esteril. Yo te sispann nan yon tib 15 mL nan medya konplè (RPMI) ak 1X tanpon dijesyon ki gen ladan 300 U / ml kolagenaz I, 60 U / ml Hyaluronidase, ak 80 U / ml DNase (Sigma). Sa yo te mete nan yon enkibatè wotasyon nan 37 degre ak 5 pousan CO2 pou 15-20 min. Lè sa a, tanpon dijesyon an te etenn ak glas-frèt konplè RPMI 1640 epi lave. Selil yo te pase nan yon filtè panyen esteril nilon 40 µm epi yo te kraze ti moso tisi ki pa dijere lè l sèvi avèk yon bouchon sereng esteril pou jenere yon sispansyon sèl selil. Si yo te wè yon kantite gwo globil wouj (RBC) ki egziste nan echantiyon an, liz RBC yo te fèt lè yo ajoute 2 mL esteril 10x ACK (Thermo Fisher Scientific).

In vivo WGP administrasyon.

Sourit yo te bay yon sèl 1 mg dòz entraperitoneal WGP dousman sonike, 3 μm pèl polystyrène (Sigma-Aldrich), oswa 3 μm mikwosfè fliyoresan (Polysciences) (tout 1 mg nan 200 ul nan esteril PBS) oswa 200 ul PBS esteril nan jou 0. Pou etid iminite tipikman antrene, 7 jou apre premye dòz IP la, sourit yo te euthanized lè l sèvi avèk CO2, epi pankreyas la ansanm ak lòt tisi ki enterese yo te retire epi trete. Pou etid dòz-titrasyon, 0.5, 1, ak 2 mg WGP yo te delivre IP nan 200 uL PBS esteril. Pou etid titration tan, sourit yo te sou fòm piki ak 1 mg WGP, epi pankreyas la te rekòlte apre 24 èdtan, 48 èdtan, 3, 7, 10, 16, ak 30 jou apre.

Ex vivo restimulation.

Pou evalye fenotip ki resevwa fòmasyon nan selil mononikleyè nan sourit trete ak WGP oswa PBS ex vivo, apre yo fin trete pankreyas la, sispansyon selil pankreyas yo te plake nan 24 plak byen ak ankouraje ak LPS (10 ng / ml), supernatant ki soti nan KPC kiltive ak Pan02. selil (40 pousan), ak recombinant MIF (rMIF) (10 ng/ml). MIF se te yon kado jenere nan men Dr Robert Mitchell nan University of Louisville e li te eksprime, pirifye ak repliye alye pwokaryotik jan sa te dekri anvan57. Selil yo te kiltive nan DMEM ak enkubasyon nan 37 degre ak 5 pousan CO2 pou 5-6 èdtan nan prezans 1X brefeldin A (BioLegend). Lè sa a, selil yo te rekòlte lè l sèvi avèk yon grate selil, lave, granules, ak Lè sa a, tache pou ekspresyon intraselilè cytokine.

Antrènman vitro ak tès restimulation.

Macrofaj peritoneal oswa selil CD11b plis ki klase ki soti nan pankreyas yon sourit yo te plake nan yon plak 24-byen pandan 2 èdtan nan 37 degre ak 5 pousan CO2 pou pèmèt selil yo atachman ak plak yo, apre sa selil k ap flote yo te dousman. aspire. Selil yo tache yo te dousman lave ak PBS esteril ak Lè sa a, resuspend nan 1 mL nan DMEM konstitye nan 10 pousan FBS ak 1 pousan penisilin / streptomycin.

Pou fòmasyon inisyal la nan selil yo, yo te ajoute 25 ug / ml nan patikil WGP, 25 ug / ml nan 3 μm polystyrène microparticle pèl (Sigma-Aldrich), oswa 100 uL nan PBS yo te ajoute nan pi apwopriye a ak enkubasyon pou 24 èdtan. Apre 24 èdtan, pwi yo te dousman lave yo retire estimilis inisyal la epi yo te ajoute DMEM fre ak selil yo te enkube ak 5 pousan CO2 nan 37 degre pou 7 jou. Apre 7 jou, medya yo te aspire, epi ranplase ak medya fre, ak selil yo te restimulated ak LPS (100 ng/mL), supernatant nan selil KPC oswa Pan02 (40 pousan), oswa PBS kòm yon kontwòl. Vennkat èdtan apre eksitasyon, supernatant yo te rekòlte epi yo te itilize nan yon ELISA pou TNF- ak IL-6.

Medya ki gen timè.

Apeprè 1 × 106 selil KPC oswa Pan02 yo te kiltive nan yon plak sis-pi nan 4 mL nan DMEM konplè nan 37 degre ak 5 pousan CO2. Apre 3 jou supernatant yo te rekòlte epi estoke nan -80 degre nan aliquot pou itilize kòm yon mwayen timè-kondisyone. Kòm yon kontwòl, pankreyas yon sourit C57BL/6 te trete nan yon sispansyon sèl selil ak 1 × 106 nan selil sa yo te kiltive nan yon plak sis-pwa nan 4 mL nan DMEM konplè ak nan 37 degre ak 5 pousan CO2, ak supernatant yo te kolekte tou apre 3 jou. Kòm yon kontwòl, pankreyas sourit nayif yo te trete nan yon sispansyon sèl-selil ak plake nan yon plak sis-pou pou 1 jou. Selil ki pa aderan yo te lave ale epi selil sa yo te kiltive pou 3 jou epi yo te rekòlte supernatant la.

Akizisyon de makrofaj peritoneal.

Yo te retire sourit yo epi yo te enjekte 5 mL RPMI esteril nan peritoneo a lè l sèvi avèk yon 25-sereng kalib. Yo te masaj vant la pou libere makrofaj peritoneal yo. Yo te fè yon ti ensizyon epi yo te itilize yon pipèt transfè pou retire sispansyon an. Lè sa a, kavite peritoneal la te lave plizyè fwa ak RPMI frèt ak selil yo te granules nan 458 × g.

Sitometri koule.

Sispansyon sèl-selil nan PBS ak 1 pousan FBS yo te bloke ak murine Fc Block (anti-CD16/CD32) nan 4 degre pou 15 min. Antikò ki make Fluorochrome pou viabilite (APC/Cy7) ak makè sifas CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, Ly6C, MHCII, CD3, CD4, CD8, NK1.1, Ki67 (Biolegend), ak CCR2 (R&D Systems) yo te itilize. Enfòmasyon ki gen rapò ak tout Abs koule yo rezime nan Tablo Siplemantè 3. Apre 30 min nan enkubasyon nan fè nwa a 4 degre, selil yo te lave ak PBS frèt epi filtre nan yon filtè may 40 µm. Yo te jwenn echantiyon yo lè l sèvi avèk yon sitomèt FACSCanto II (BD Biosciences) epi yo te analize lè l sèvi avèk lojisyèl FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). FACSDiva lojisyèl vèsyon 6 te itilize nan FACSCanto pou jwenn tout done yo.

tach intraselilè pou ekspresyon cytokines.

Apre eksitasyon, selil yo te tache pou makè sifas yo vle jan sa dekri pi wo a. Lè sa a, selil yo te lave ak PBS frèt, epi yo te ajoute 500 ul nan tanpon fixation (Biolegend) nan tib yo, yon ti tan toubiyon, ak enkube nan fè nwa a nan tanperati chanm pou 20 min. Apeprè 1 ml tanpon pèmeabilizasyon (Biolegend) te ajoute epi echantiyon yo te santrifuje nan 458 × g pou 5 min nan 4 degre ki te swiv pa yon lòt lave lè l sèvi avèk 1 ml tanpon pèmeabilizasyon. Selil yo te resuspend nan 200 ul nan tanpon pèmeabilizasyon ak selil yo te tache ak antikò kont TNF-, Ki67, Granzyme-B, IL12, IL-6, ak IFN oswa kontwòl la izotip respektif lannwit lan nan 4 degre. Lè sa a, selil yo te lave, filtre, ak done yo te akeri lè l sèvi avèk yon sitomèt koule.

FACS izòlman CD11b plis makrofaj pou fòmasyon vitro.

Pankreyas la te trete nan yon sispansyon yon sèl selil jan sa dekri pi wo a. Selil yo te lave ak 1 mL PBS, epi enkubate ak blòk Fc pou 10 min nan 4 degre ki te swiv pa tach ak lank viabilite (APC-Cy7), CD45 (PerCPcy5), ak CD11b plus (APC) pou 30 min nan 4 degre. Selil yo te lave ak PBS epi yo te resuspend nan frèt MACS Running Buffer (Miltenyi Biotech). ViabilityCD45 plis CD11b plis selil yo te klase lè l sèvi avèk yon FACS Aria III (BD Biosciences). Selil yo te kolekte nan 50 pousan FBS, 40 pousan PBS, ak 10 pousan HEPES (Corning). Apre klasman selil yo te lave ak PBS ak Lè sa a, plake pou fòmasyon in vitro, jan sa dekri pi wo a.

ELISA.

Supernatant ki soti nan selil ki antrene in vitro ansanm ak estanda yo te analize lè l sèvi avèk twous ELISA murin TNF- ak IL-6 (BioLegend). Yo te fè tès la dapre enstriksyon manifakti a ak tout kondisyon yo te fèt an triple. Yo te itilize yon twous ELISA pou rMIF (sistèm R ak D) tou dapre enstriksyon manifakti a pou quantifier rMIF nan Pan02 ak KPC timè-kondisyone medya ak supernatant ki soti nan kiltive selil pankreyas ki pa trete. Pou evalye modifikasyon histon yo, yo te achte twous ELISA (Tri-methyl histone H3K4 quantification kit, Acetyl-histone H3K27 quantification kit, Tri-methyl histone H3K27 quantification kit, ak total histone H3 quantification kit) yo te achte nan men EpiGentek epi yo te fè tès ki baze sou manifakti a. enstriksyon yo. Laktat te mezire pa L-Lactate assay Kit I (Eton Bioscience).

Analiz Western blot.

CD11b plis selil ki soti nan sourit PBS-enjekte oswa WGP-enjekte (24 h) yo te separe lè l sèvi avèk CD11b microbeads (Miltenyi Biotech). Histone te extrait selon enstriksyon manifakti a (Active Motif, Inc.), epi konsantrasyon pwoteyin yo te detèmine lè l sèvi avèk quantification Bradford. Pwoteyin histon yo te separe pa jèl SDS-PAGE 15 pousan Tris-HCl epi yo te transfere sou manbràn PVDF (Millipore). Manbràn an te bloke ak 5 pousan BSA nan tanperati chanm pou 1 èdtan ak enkubasyon lannwit lan nan 4 degre ak antikò prensipal ki gen ladan tri-methyl-histone H3 (lys4) mAb lapen, acetyl-histone H3 (lys27) XP lapen mAb, tri-methyl -histone H3 (Lys27) lapen mAb, ak histone H3 XP lapen mAb (Cell Signaling Technology), Lè sa a, enkube ak HRP-konjige antikò segondè (GE Healthcare) nan tanperati chanm pou 1 èdtan. Manbràn lan te devlope ak Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) epi li te detekte atravè Medical Film Processor (Konica Minolta Medical & Graphic). Precision Plus Pwoteyin Kaleidoscope Prestained Pwoteyin Creole yo te itilize kòm yon makè pwoteyin estanda (Bio-Rad).

qRT-PCR.

Apre selil CD11b plis yo te izole nan pankreyas sourit la nan sourit WGP-trete ak sourit ki pa trete, selil yo te sove nan TRIzol. RNA yo te izole ak ranvèse transkri lè l sèvi avèk anplifikasyon TaqMan Reverse Transcription Reagents (qRTPCR) lè l sèvi avèk sistèm deteksyon Bio-Rad MyiQ yon sèl koulè RT-PCR. Yon ti tan, cDNA te anplifye nan yon melanj reyaksyon 25 uL ki gen ladan SYBR Green PCR super-melanj (Bio-Rad), 100 ng nan modèl ADN konplemantè, ak primè chwazi (200 nM) lè l sèvi avèk kondisyon yo monte bisiklèt rekòmande.

H plis E.

Sèt jou apre enjeksyon ak pèl PBS/mikwopartikul oswa WGP, yo te rekòlte pankreya a epi yo te fikse nan fòmalin 4 pousan pou 1 semèn ki te swiv pa entegre nan parafin dapre pwosedi estanda. Tisi parafine ki entegre yo te koupe an seksyon 5 mm epè epi yo tache ak ematoksilin ak eozin (H & E) pou analiz mòfolojik.

Mezi amilaz serom.

Amylase sewòm murin te mezire lè l sèvi avèk Amylase Activity Assay Kit (Millipore Sigma) epi yo te itilize dapre enstriksyon manifakti a. Nan ti bout tan, sourit yo te sou fòm piki ak WGP ak 7 jou apre, yo te kolekte san nan sourit lè l sèvi avèk yon teknik retro-bulbar senyen. Yo te itilize echantiyon sa yo pou fè tès pou amilaz serik.

In vivo rediksyon selil T.

Selil T yo te apovri lè l sèvi avèk yon mAb anti-CD4 pou kont li, mAb antiCD8 pou kont li, oswa mAb anti-CD4 ak anti-CD8 ansanm. Antikò yo te fè nan kay la. Nan pwosedi rediksyon sa a, sourit yo te enjekte IP ak WGP nan jou 1 epi yo te tou enjekte IP ak 200 µg mAb yo nan jou 1 ak jou 4 pandan peryòd tretman an. Sourit yo te euthanized nan jou 7. (CD4 script GK1.5, CD8 script 53-6.72). Efikasite rediksyon te konfime nan jou 7.

Nan vivo NK selil appauvrissement.

Selil NK yo te diminye atravè piki intraperitoneal 100 µg PK136 mAb (ki pwodui nan laboratwa Dr Jun Yan nan University of Louisville) nan jou -1 ak 5 pandan peryòd tretman an. WGP te sou fòm piki nan jou 0 ak jou 7 bèt yo te euthanized ak efikasite nan rediksyon nan selil NK te evalye pa tach tisi pankreyas pou NK1.1.

rediksyon Ly6G.

Netrofil yo te diminye lè yo te enjekte 300 µg anti-Ly6G mAb (Bio X Cell) oswa kontwòl izotip Rat IgG2a (Bio X Cell) nan jou -1, 2, ak 6 pandan tretman an. Apeprè 1 mg nan WGP enjekte IP nan jou 1. Sourit yo te euthanized nan jou 7 ak pankreyas la te evalye pou efikasite nan appauvrissement. Nan timè a, sourit modèl yo te enjekte ak 300 µg anti-Ly6G mAb oswa kontwòl izotip Rat IgG2a nan jou -2, 4, 10, ak 16. Sourit yo te bay WGP nan jou 0 epi yo te implanté ak orthotopic KPC timè pankreyas nan jounen an. 7. Sourit yo te euthanized nan jou 21 ak tisi pankreyas yo te tache ak Ly6G pou evalye efikasite rediksyon granulosit nan moman sa a.

CyTOF mas Cytometry echantiyon preparasyon.

Antikò sitometri mas yo te swa achte nan men Fluidigm oswa yo te kreye andedan kay la lè yo konjige antikò pirifye ki disponib nan komès ak izotòp metal apwopriye lè l sèvi avèk MaxPar X8 Polymer oswa MCP9 Polymer kits (Fluidigm). Yo te trete echantiyon pankreyas ki soti nan twa sourit PBS ak twa 7-jou WGP nan yon solisyon sèlil epi yo te fè eksitasyon ex vivo jan sa dekri pi wo a. Selil yo te dousman grate nan plak yo lè l sèvi avèk yon grate selil esteril, lave ak PBS, epi yo mete yo nan yon tib kilti esteril. Yo te itilize apeprè 2 × 106 selil pou chak echantiyon. Selil yo te premye tache pou viabilite ak 5 uM cisplatin (Fluidigm) nan RPMI 1640 san serom pou 5 min nan RT. Lè sa a, selil yo te lave ak RPMI 1640 ki gen 10 pousan FBS pou 5 min nan 300 × g. Selil yo te tache ak antikò sifas yo pou 30 min nan RT epi lave de fwa ak tanpon Maxpar Cell tach (Fluidigm).

Pou tach sou sitokin intraselilè, selil yo te fikse ak 1 mL tanpon 1X Maxpar Fix I pou 30 min nan RT epi lave de fwa ak 2 mL tanpon 1X Maxpar Perm-S pou 5 min nan 800 × g. Lè sa a, te ajoute cocktèl antikò sitoplasmik / sekrè a epi enkube ak selil yo pou 30 minit nan RT. Apre enkubasyon, selil yo te lave ak 1 mL tanpon 1X Maxpar Perm-S pou 5 min nan 800 × g epi dousman efase pou retire tout likid nan tib la.

Pou tach pou antijèn nikleyè, selil yo te sispann nan 1 mL nan tanpon tach antijèn nikleyè 1X Maxpar pou 30 minit nan RT. Lè sa a, te ajoute bwason antikò antijèn nikleyè a epi enkube pou 30 minit nan RT. Selil yo te lave de fwa pou 5 min nan 800 × g ak 2 mL tanpon pèmeyabilite tach antijèn nikleyè. Finalman, selil yo te fikse ak 1.6 pousan fòmaldeyid pou 10 minit nan RT, Lè sa a, enkube lannwit lan nan 125 nM nan IntercalatorIridium (Fluidigm) nan 4 degre.

CyTOF done akizisyon.

Yon fwa ke selil yo te pare pou akizisyon, echantiyon yo te lave de fwa ak selil tach tanpon (Fluidigm) epi kenbe yo sou glas pandan y ap tann akizisyon. Dirèkteman anvan akizisyon an, selil yo te sispann nan yon solisyon 1:9 nan solisyon akizisyon selilè: EQ 4 pèl kalibrasyon eleman (Fluidigm). Yo te itilize yon sistèm Helios CyTOF, epi apre pwosedi apwopriye demaraj ak ajisteman, echantiyon yo te kouri nan yon vitès ki mwens pase oswa egal a 500 evènman / segonn jiska 300, 000 evènman. Sèvi ak lojisyèl CyTOF, dosye FCS yo te nòmalize.Fichye FCS ak dosye sa yo te Lè sa a, pare pou analiz done.

Analiz done CyTOF.

Done CyTOF yo te analize lè l sèvi avèk FlowJo, pake lojisyèl CytoBank58, ak workflow CyTOF59 ki gen ladann yon seri pakè ki disponib nan R (r-project. org)60–63. Pou analiz ki fèt nan workflow CyTOF, yo te itilize fichye espas travay FlowJo ekspòte soti nan Flow Workspace ak CytoML61.

RNA sekans: ekstraksyon RNA ak izolasyon.

Sèt jou apre administrasyon PBS oswa WGP IP, pankreata yo te rekòlte, trete nan yon sèl sispansyon selil, tache pou viabilite, CD45, ak CD11b, ak klase lè l sèvi avèk yon FACS Aria III. Yo te prepare echantiyon yo an triple pou chak gwoup eksperimantal. Yon fwa yo te izole selil myeloid sa yo, yo te lave selil yo 2 fwa ak PBS ki frèt epi liz ak Trizol (Invitrogen). RNA yo te ekstrè lè l sèvi avèk yon QIAGEN RNAeasy Kit (QIAGEN).

Yo te tcheke RNA izole a pou entegrite lè l sèvi avèk sistèm Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) epi yo te mezire lè l sèvi avèk yon tès fluoometrik Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Bibliyotèk mRNA-Seq ki anrichi Poly-A yo te prepare apre pwotokòl estanda kit Universal Plus mRNASeq (Tecan Genomics, Redwood City, CA) lè l sèvi avèk 10 ng RNA total.

Tout echantiyon yo te ligated ak adaptè Illumina ak endividyèlman barcoded. Absans dimè adaptè yo ak yon gwosè bibliyotèk ki konsistan nan ~ 300 bp te konfime lè l sèvi avèk Agilent Bioanalyzer 2100 la. Yo te evalye konsantrasyon bibliyotèk la ak konpòtman sekans sou yon nivo estanda PhIX lè l sèvi avèk yon selil koule sekans Nano MiSeq ki soti nan Illumina. 1.8 pm nan bibliyotèk yo pisin ak 1 pousan PhiX spike-in te chaje sou yon sèl NextSeq 500/550 75 sik High Output Kit v2 selil koule sekans ak sekans sou sekansè Illumina NextSeq 500 vize 60 M 1x75 bp lekti pou chak echantiyon.

Sekans RNA.

Bibliyotèk yo te prepare lè l sèvi avèk twous Universal Plus mRNA-seq ak quantification bibliyotèk NuQuant® (NuGen). Sis echantiyon yo te gaye sou kat liy sekans nan yon sèl kouri. 24 dosye sekans anvan tout koreksyon (.fastq)64 yo te telechaje soti nan BaseSpace65 Illumina sou sèvè KBRIN pou analiz. Kontwòl kalite (QC) nan done yo sekans anvan tout koreksyon te fèt lè l sèvi avèk FastQC (vèsyon 0.10.1)66. Sekans yo te aliyen ak jenom referans sourit mm10 lè l sèvi avèk STAR (vèsyon 2.6)67, ki te kreye dosye aliyman an fòma bam. Ekspresyon diferan nan transkripsyon ENSEMBL pwoteyin-kodaj yo te fèt lè l sèvi avèk DESeq268,69. Konte kri yo te jwenn nan dosye fòma bam ki aliye ak STAR yo lè l sèvi avèk HTSeq (vèsyon 0.10.0)70. Konte anvan tout koreksyon yo te nòmalize lè l sèvi avèk metòd Relative Log Expression (RLE) ak Lè sa a, filtre yo eskli jèn ki gen mwens pase dis konte atravè echantiyon yo71. Done RNA-seq yo te depoze ak GEO asansyon GSE187464.

Sekans RNA: analiz anrichisman seri jèn.

Te gen analiz anrichisman seri (GSEA) itilize pou plis karakterize byoloji jèn yo ki gen ladan kondisyon WGP vs PBS ak diferans yo72. Gen seri yo te jwenn nan baz done siyati molekilè (MSigDB) pou pwosesis byolojik Gene Ontology (GO) ak chemen Reactome. Pou chak seri jèn, tout kote jèn yo teste nan konparezon sourit kontwòl WGP ak PBS-trete yo te klase soti nan pi wo a pi ba siyifikasyon lè l sèvi avèk valè p. Apwòch sa a pèmèt jèn ki gen anpil enpòtans monte ak downregulated yo dwe enkli nan chak seri jèn, yon apwòch ki pi byen reflete kondisyon yo nan yon chemen byolojik. Pou analiz sa a, yon tablo ansanm anrichi yo swiv pa yon trase anrichisman ki montre pwofil nòt anrichisman an (ES) ak pozisyon manm seri jèn yo sou lis ki òdone ran.

Sekans sèl selil: izolasyon selil sèl ak sekans RNA.

Selil CD45 plus vivan yo te klase nan pankreyas sourit yo, yo lave yo epi yo te resispann yo nan 1x PBS (san kalsyòm ak mayezyòm) ki gen 0.04 pousan BSA. Selil sèl yo te kaptire epi yo te konstwi bibliyotèk cDNA ki gen kòd bar lè l sèvi avèk Chromium Next GEM Single-Cell 3ʹ Reagent Kit (v3.1, 10X Genomics) ak Chromium Controller la, dapre enstriksyon manifakti a. Bibliyotèk yo te pisin ak sekans lè l sèvi avèk yon konfigirasyon 28 bp × 8 bp × 125 bp pou read1 × i7 endèks x read2 sou Illumina NextSeq 500 ak NextSeq 500/550 150 sik High Output Kit v2.5 (20024907).

Depi selil sekans: pwofil ekspresyon jèn.

Fichye Bcl yo te demultiplexed nan dosye fastq lè l sèvi avèk lojisyèl CellRanger (10X Genomics, v3.1.{{10}}). Kantite total lekti sekans te 506,913,062. Lekti yo te bon jan kalite jan FastQC66 detèmine. Konte jèn yo te mezire lè l sèvi avèk "konte" CellRanger, lè l sèvi avèk jenom referans selil ranger-mm10-3.0.0 pou sourit yo. Yo te pwodwi yon matris konte pou chak echantiyon ak yon echantiyon total ak kantite selil yo espere mete nan 5000.

Done konte anvan tout koreksyon detèmine pa CellRanger te itilize kòm opinyon nan yon tiyo analiz koutim nan R ki sèvi ak yon varyete zouti analiz sèl selil ki baze sou Seurat. Trase jenou an (figi siplemantè 7b) montre yon graf ki montre konte UMI klase pou chak kòd bar selilè pou done total atravè twa gwoup yo. Selil ki anlè pwen enfleksyon an reprezante doubt posib pandan ke sa ki anba jenou an reprezante selil background yo. Yo te analize mezi kontwòl kalite selil yo lè l sèvi avèk Seurat v373, epi yo te retire kòd bar selil ki gen karakteristik sa yo nan analiz la: konte ki ba (selil background posib) ak yon koupe FDR nan 0.01 nan fonksyon DropletUtils74 "emptyDrops", gwo konte (selil doublet posib) ki gen plis konte pase pwen enfleksyon nan trase jenou, kontni mitokondriyo ki pi gran pase 30 pousan ak kontni ribozomal ki pi gran pase 40 pousan. Gene (karakteristik) yo te plis filtre yo retire idantifyan jèn retrete ak jèn ki pa te eksprime nan omwen de selil. Gade Figi Siplemantè 7a, b pou nimewo inisyal ak filtre kòd bar selil ak jèn yo.

Done ekspresyon yo te nòmalize lè l sèvi avèk SCTransform75 kote jèn sik selil, kontni ribosomal, ak kontni mitokondriyo yo te regrese. Lè sa a, selil yo te gwoupe epi yo te fè rediksyon dimansyon lè l sèvi avèk UMAP76. Yo te bay non premye gwoup yo lè l sèvi avèk yon teknik nòt anrichisman modifye GSVA77,78. Pou chak nan grap sa yo, yo te idantifye premye jèn makè yo. Seurat73 ak MAST79 te detèmine jèn ki te eksprime diferan ki konpare chak gwoup ak tout lòt gwoup (tout konparezon par paires). Done scRNA-seq yo te depoze ak GEO asansyon GSE187464.

Idantifikasyon grap ki te pwodwi ak scRNA-Seq.

Gwoup ki pa sòti nan myeloid yo te klase jeneralman kòm selil B (MS4A1), selil plasma (SDC1), CD8 plis selil T (CD3e, C8a), CD4 plis selil T (CD3e, CD4), selil T-regilasyon (T). -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), δ T-selil (CD3e, TRGC1, TRGC2,IL7Ra) ak tip 2 selil iminitè natirèl (ILC2s) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg, GATA3, IL-5 , IL-13, ICOS ak Rxrg)80–82. Netrofil yo te idantifye atravè ekspresyon MMP9, Csf3r, S100A8, S100A8, ak ADAM8, menm si yo ka pa reprezante nan analiz sa yo akòz kontni RNA ki ba yo ak nivo segondè nan RNases83 intrinsèques. Selil dendritik konvansyonèl yo (cDCs) yo te idantifye atravè ekspresyon ITGAX ak ITGAE ak plasmacytoid DCs (pDCs) te idantifye pa ITGAX ak Siglech.

Klasifikasyon grap myeloid soti nan scRNA-Seq.

Gwoup 5 te eksprime ITGAMIntADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- epi li pa te eksprime TNFAIP2, sa ki endike ke selil sa yo se makrofaj rezidan yo. Cluster10 eksprime ITGAM- HiADGRE1HiLyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2-. Gwoup 3 ak 4 te eksprime ITGAMInt ADGRE1Int Lyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2Hi, ki sijere ke tou de se sou-ansanm monosit/makrofaj ki enfiltre yo, menmsi jèn enflamatwa yo te eksprime nan grap 3 yo te itilize pou idantifye grap 3 kòm monosit enflamatwa/macrophages enfiltrasyon. .

Esè fagositoz.

Pankreyas sourit ki enjekte PBS/mikwopartikul ak sourit ki antrene WGP in vivo yo te rekòlte 7 jou apre piki epi trete jan sa dekri anvan an nan yon sèl sispansyon selil. Apeprè 2 × 106 yo te lave ak HEPES dilye 50x nan RPMI 1640 ak Lè sa a, enkube nan 100 μL nan solisyon sa a pou 1 èdtan nan 37 degre yo aktive selil yo. Invitrogen a ankouraje Green S.

Aureus BioParticlesTM Phagocytosis Twous pou Flow Cytometry (Thermo Fisher Scientific) te itilize dapre enstriksyon manifakti a. Apeprè 100 μL nan patikil rekonstitye yo oswa 1 × 106 GFP plis selil timè KPC yo te ajoute nan selil pankreyas yo aktive ak enkubasyon pou 1 èdtan nan 37 degre. Echantiyon yo te dousman toubiyon chak 15 minit. Yo te sispann reyaksyon an lè w ajoute 1 mL PBS frèt. Echantiyon yo te enkube ak Fc Block pou 10 minit nan 4 degre, tache pou viabilite, CD45, CD11b, ak F4/80 pou 30 minit nan 4 degre, epi analize lè l sèvi avèk yon BD FACSCanto. Pou analiz, apre yo fin gating sou selil vivan yo ak CD45, selil ki fliyoresan nan kanal FITC yo te detèmine yo dwe fagositik.

Esè sitotoksisite.

Pankreyas ki soti nan sourit WGP ak PBS trete yo te rekòlte epi popilasyon CD11b plis yo te izole lè l sèvi avèk mayetik CD11b plis MicroBeads (Miltenyi Biotec) ak yon AutoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec). Lè sa a, selil CD11b pirifye yo te lave epi konte, epi yo te plake sa yo nan yon rapò 1:20 timè: selil efèktè nan yon plak 96-byen. Tout echantiyon eksperimantal yo te kouri an triple. Apre plake CD11b plis selil yo, ROS inhibiteurs N-acetyl-Lcysteine ​​(NAC) (1 mM, Sigma-Aldrich), Trolox (5 μM, Sigma-Aldrich), oswa DFO (50 μM, Farmakope Ewopeyen an) yo te ajoute nan youn. seri selil ki sòti PBS ak WGP pou 1 èdtan anvan adisyon a nan 5000 lisiferaz-eksprime KPC plis selil timè pankreyas nan tout pwi yo. Apre 24 èdtan, nan ko-kilti, plak yo te santrifuje ak 20 µL nan supernatant la te melanje ak 100 µL nan reyaktif la Luciferase Assay (Promega). Aktivite lisiferaz yo mezire nan supernatant la korelasyon ak selil timè ki te touye pa selil efèktè yo epi yo te mezire lè l sèvi avèk yon luminomètr (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation). Siyal lisiferaz espontane ki soti nan selil timè plake yo te soustraksyon nan mezi supernatant la. Valè lisiferaz yo reprezante kòm inite limyè relatif (RLUs).

Modèl timè in vivo nan kansè nan pankreyas.

Yon liy selilè KPC sou yon background C57BL/6 ki sòti nan LSL-KrasG12D/plus; LSL-Trp53R172H/ plis ; Modèl sourit Pdx1-Cre (KPC) te achte nan men Ximbio. Sa yo ak selil Pan02 ki te yon kado jenere nan men Dr Yong Lu nan Wake Forest University yo te itilize nan yon modèl ortotopik nan kansè nan pankreyas. Yon liy KPC transfekte ak GFP ak luciferase (KPCGFP plis Luc plus) te tou yon kontribisyon jenere nan men Dr Michael Dwinell nan Medical College of Wisconsin. Selil sa yo te itilize sèlman nan sourit albino C57BL/6.

Pou enplantasyon timè, sourit yo te anestezi lè l sèvi avèk isoflurane, ak vant sourit yo te prepare ak betadine ak anvlope nan yon mòd esteril. Yo te fè yon laparotomi liy mitan 2 cm lè l sèvi avèk yon teknik aseptik ak enstriman esteril. Apre laparotomi, pankreyas la, ak larat yo te ekstèn. Selil timè yo te sispann nan PBS glas-frèt ak melanje nan yon rapò 1: 1 ak matris manbràn sousòl Matrigel (Corning). 0.1 × 106 selil timè nan 50 uL nan solisyon PBS-matrigel yo te enjekte nan ke pankreyas la lè l sèvi avèk yon sereng ensilin 30-kalib. Fòmasyon an nan yon ti ti wonn endike enplantasyon siksè. Peritoneum la te fèmen lè l sèvi avèk kouvwi asid polyglycolic trese absorbable 5/0 suture ak po a te fèmen lè l sèvi avèk swa trese nonabsorbable suture 5/0. (CP Medikal). Buprenorphine te administre pou jesyon doulè jiska 72 èdtan apre operasyon ak sourit yo te kontwole.

D 'in vivo.

Sourit implanté orthotopically ak GFP plis Luciferase plis KPC timè selil yo te enjekte IP ak 150 mg/kg nan pwa kò nan 100 µL XenoLight D-Luciferin-K plis Sèl Bioluminescent Substrate (PerkinElmer). Apre 10 minit, sourit yo te anestezi ak isoflurane epi yo mete yo andedan yon Biospace Lab Photon Imager, ki se yon nivo dedye ba-limyè nan modalité optik vivo pou D 'bioluminesan ak fliyoresan. Imaj sourit yo te pran epi yo itilize pou mezire gwosè timè ak kwasans.

Modèl timè melanj.

Sourit yo te antrene ak 1 mg WGP ak 7 jou apre popilasyon CD11b plis CCR2 plis ak CD11b plis CCR2- yo te klase ak melanje 1: 1 ak selil timè KPC 1 × 105 selil timè. Selil yo te implanté orthotopically nan sourit WT ak 3 semèn pita sourit yo te euthanized ak gwosè timè yo te evalye.

Terapi konbinezon ak anti-PD-L1 mAb.

Sourit C57BL/6 yo te trete ak WGP nan jou -7 epi yo te implanté ak timè pankreyas ortotopik KPC nan jou 0. Sourit yo te trete ak 200 µg anti-sourit anti-PD-L1 mAb (Bio X Cell) oswa Rat IgG2b izotip kontwòl (Bio X Cell) nan jou 3, 7, ak 11. Lè sa a, sourit yo te kontwole pou siviv.

WGP kòm yon tretman.

Sourit C57BL/6 yo te implanté ak timè pankreyas ortotopik KPC nan jou 0 epi nan jou 4 ak 11 sourit yo te bay 1 mg IP WGP oswa PBS. Lè sa a, sourit yo te kontwole pou yo siviv.

Analiz estatistik.

Tout rezilta yo te repete omwen twa fwa endepandan pou verifye sof si sa presize. Yo montre rezilta reprezantan yo. Rezilta yo reprezante kòm mwayen ± SEM. Done yo te analize lè l sèvi avèk yon tès t Student a de ke oswa tès U Mann–Whitney. Konparezon miltip gwoup yo te fèt lè l sèvi avèk yon ANOVA yon sèl-fason oswa de-fason ki te swiv pa tès konparezon miltip Tukey yo. Analiz korelasyon yo te fèt lè l sèvi avèk koyefisyan korelasyon Pearson (distribisyon nòmal). Yo te fikse siyifikasyon estatistik nan p < 0.05. Tout analiz estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk GraphPad Prism Software Version 9 (GraphPad Inc., La Jolla, CA).

Rezime rapò.

Gen plis enfòmasyon sou konsepsyon rechèch ki disponib nan rezime rapò rechèch la nati ki lye nan atik sa a.

Done disponiblite

Done sous yo bay nan papye sa a. Done RNASeq yo disponib anba GEO aksesyon GSE187464, ak done scRNA-Seq yo disponib anba GEO aksesyon GSE187464 Done sous yo bay nan papye sa a.

Resevwa: 2 avril 2021; Aksepte: 17 janvye 2022.

Referans

1. ACS. Reyalite ak Chif kansè 2020.

2. Rahib, L. et al. Pwojeksyon ensidans kansè ak lanmò jiska 2030: fado inatandi kansè tiwoyid, fwa, ak pankreyas Ozetazini. Kansè Res. 74, 2913–2921 (2014).

3. Kommalapati, A., Tella, SH, Goyal, G., Ma, WW & Mahipal, A. Jesyon kontanporen nan kansè nan pankreyas ki lokalize rezekabl. Kansè 10, 24 (2018).

4. Bliss, LA, Witkowski, ER, Yang, CJ & Tseng, JF Rezilta nan jesyon operasyon kansè nan pankreyas. J. Surg. Oncol. 110, 592–598 (2014).

5. Schizas, D. et al. Iminoterapi pou kansè nan pankreyas: yon aktyalizasyon 2020. Trete kansè. Rev. 86, 102016 (2020).

6. Henriksen, A., Dyhl-Polk, A., Chen, I. & Nielsen, D. Inibitè Checkpoint nan kansè nan pankreyas. Trete kansè. Rev. 78, 17–30 (2019).

7. Madden, K. & Kasler, MK Inibitè pòs iminitè nan kansè nan poumon ak melanom. Semin. Oncol. Enfimyè. 35, 150932 (2019).

8. Kao, HF & Lou, PJ Inibitè pòs iminitè pou tèt ak kou kansè selil squamous: Peyizaj aktyèl ak direksyon nan lavni. Tèt. Neck 41, 4–18 (2019). 9. Leinwand, J. & Miller, G. Règleman ak modulasyon iminite antitumoral nan kansè nan pankreyas. Nat. Imunol. 21, 1152–1159 (2020).

10. Royal, RE et al. Faz 2 esè yon sèl ajan Ipilimumab (anti-CTLA-4) pou adenokarcinom pankreyas lokalman avanse oswa metastatik. J. Immunother. 33, 828–833 (2010).

11. O'Reilly, EM et al. Durvalumab avèk oswa san tremelimumab pou pasyan ki gen metastatik pankreyas ductal adenocarcinoma: yon faz 2 esè klinik owaza. JAMA Oncol. 5, 1431–1438 (2019).

12. Weiss, GJ et al. Faz Ib/II etid nan gemcitabine, nab-paclitaxel, ak pembrolizumab nan metastatik adenokarcinom pankreyas. Envesti. New Drugs 36, 96–102 (2018). 13. Whatcott, CJ, Posner, RG, Von Hoff, DD & Han, H. nan Pankreyas Kansè ak Mikroenvironment Timè (eds Grippo, PJ & Munshi, HG) Ch. 8 (Transworld Research Network, 2012).

14. Karamitopoulou, E. Mikwo anviwònman timè nan kansè nan pankreyas: jaden flè iminitè a dikte pa karakteristik molekilè ak istopatolojik. Br. J. Kansè 121, 5–14 (2019).

15. Daniel, SK, Sullivan, KM, Labadie, KP & Pillarisetty, VG Hypoxia kòm yon baryè pou iminoterapi nan adenokarcinom pankreyas. Clin. Transl. Med. 8, 10–10 (2019).

16. Wang, W. et al. RIP1 kinaz kondui tolerans iminitè adaptab nan makrofaj nan kansè nan pankreyas. Cancer Cell 38, 585–590 (2020).

17. Netea, MG et al. Iminite ki antrene: yon pwogram memwa iminitè natirèl nan sante ak maladi. Syans 352, aaf1098 (2016).

18. Bekkering, S. et al. Endiksyon metabolik nan iminite antrene atravè chemen mevalonate la. Selil 172, 135–146 e139 (2018).

19. van der Heijden, C. et al. Epigenetics ak iminite antrene. Antioksid. Redox siyal. 29, 1023–1040 (2018).

20. Priem, B. et al. Terapi iminite ki antrene nanobiyoloji siprime kwasans timè ak potansye anpèchman pòs. Selil 183, 786–801 e719 (2020).

21. Kalafati, L. et al. Fòmasyon iminitè natirèl nan granulopoyèz fè pwomosyon aktivite antitumoral. Selil 183, 771–785 e712 (2020).

22. Mitroulis, I. et al. Modulation myelopoiesis progenitors se yon eleman entegral nan iminite ki resevwa fòmasyon. Selil 172, 147–161.e112 (2018).

23. Bekkering, S., Dominguez-Andres, J., Joosten, LAB, Riksen, NP & Netea, MG Iminite ki antrene: repwogram iminite natirèl nan sante ak maladi. Annu Rev Immunol. 39, 667–693 (2021).

24. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F. & Gomez Perdiguero, E. Devlopman ak fonksyon tisi-rezidan macrophages nan sourit. Semin. Imunol. 27, 369–378 (2015). 25. Calderon, B. et al. Anatomi pankreyas yo kondisyone orijin ak pwopriyete makwofaj rezidan yo. J. Exp. Med. 212, 1497–1512 (2015).

26. Kim, H. Faktè transcription MafB ankouraje polarizasyon anti-enflamatwa M2 ak kolestewòl eflu nan makrofaj. Sci. Rep. 7, 7591 (2017).

27. Kim, SY et al. Efè anti-enflamatwa nan apocynin, yon inibitè nan NADPH oksidaz, nan enflamasyon Airway. Imunol. Selil Biol. 90, 441–448 (2012).

28. Liu, M. et al. Faktè transcription c-Maf se yon pòs ki pwograme makrofaj nan kansè nan poumon. J. Clin. Envesti. 130, 2081–2096 (2020).

29. Zimmerman, KA et al. Sekans RNA yon sèl selil idantifye siyati ekspresyon jèn makwofaj rezidan ren kandida yo atravè espès yo. J. Am. Soc. Nefròl. 30, 767–781 (2019).

30. Bakos, E. et al. CCR2 kontwole repons iminitè a pa modil entèkonvèsyon ak fonksyon selil T effector ak regilasyon. J. Immunol. 198, 4659–4671 (2017).

31. Kurihara, T., Warr, G., Loy, J. & Bravo, R. Defo nan rekritman makrofaj ak defans lame nan sourit ki manke reseptè a chemokine CCR2. J. Exp. Med. 186, 1757–1762 (1997).

32. Kuziel, WA et al. Gwo rediksyon nan adezyon leukozit ak ekstravazasyon monosit nan sourit ki manke nan CC chemokine reseptè 2. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 12053–12058 (1997).

33. Kratofil, RM, Kubes, P. & Deniset, JF Monocyte konvèsyon pandan enflamasyon ak blesi. Arterioscler. Tronc. Vasc. Biol. 37, 35–42 (2017).

34. Funamizu, N. et al. Faktè inhibitor migrasyon makrofaj pwovoke tranzisyon epitelyal ak mesenchymal, amelyore agresif timè, ak predi rezilta klinik yo nan adenokarcinom ductal pankreyas rezekte. Ent. J. Kansè 132, 785–794 (2013).

35. Denz, A. et al. Anpèchman MIF mennen nan arestasyon sik selilè ak apoptoz nan selil kansè nan pankreyas. J. Surg. Res. 160, 29–34 (2010).

36. Su, LJ et al. Peroksidasyon lipid ki pwovoke espès oksijèn reyaktif nan apoptoz, otofaji, ak ferroptoz. Oksid. Med. Cell Longev. 2019, 5080843 (2019).

37. Geller, A., Shrestha, R. & Yan, J. Leven-derived -glucan in cancer: roman uses of a traditional therapeutic. Ent. J. Mol. Sci. 20, 3618 (2019).

38. Shrivastava, P. & Bhatia, M. Wòl esansyèl nan monosit ak makrofaj nan pwogresyon nan pankreatit egi. Mondyal J. Gastroenterol. 16, 3995–4002 (2010).

39. Wang, J. & Kubes, P. Yon rezèvwa nan macrophages kavite ki gen matirite ki ka rapidman anvayi ògàn visceral yo afekte reparasyon tisi. Selil 165, 668–678 (2016).

40. Qi, C. et al. Diferans chemen reglemante repons iminitè natirèl ak adaptasyon antitumoral pa patikil ak idrosolubl -glucans ki sòti nan ledven. San 117, 6825–6836 (2011).

41. Goodridge, HS et al. Aktivasyon nan reseptè iminitè natirèl Dectin-1 lè yo fòme yon 'sinaps fagositik'. Nati 472, 471-475 (2011).

42. Masuda, Y. et al. Administrasyon oral nan idrosolubl -glucans ekstrè nan Grifola frondosa pwovoke yon repons iminitè sistemik antitumoral ak diminye imunosuppresyon nan sourit ki gen timè. Ent. J. Kansè 133, 108–119 (2013).

43. Rice, PJ et al. Famakokinetik chanpiyon (1-3)-beta-D-glukan apre yo pran nan venn nan rat yo. Ent. Immunopharmacol. 4, 1209–1215 (2004).

44. Huang, Y. et al. S1P-depandan trafik entè-ògàn nan gwoup 2 selil lenfoyid natirèl sipòte defans lame. Syans 359, 114–119 (2018).

45. Mathä, L. et al. Migrasyon nan gwoup rezidan nan poumon 2 selil lenfoyid natirèl lye enflamasyon alèjik nan poumon ak iminite fwa. Devan. Imunol. 12, 67950 (2021).

46. ​​Ricardo-Gonzalez, RR et al. Tisi-espesifik chemen ekstrè aktive ILC2s gaye iminite tip 2. J. Exp. Med. 217, e2019117 (2020).

47. Mattiola, I. & Diefenbach, A. Pèmèt iminite anti-timè pa debouche ILC2. Selil Res. 30, 461–462 (2020).

48. Qian, BZ & Pollard, JW Macrophage divèsite amelyore pwogresyon timè ak metastaz. Selil 141, 39–51 (2010).

49. Qian, BZ et al. CCL2 rekrite monosit enflamatwa pou fasilite metastaz timè nan tete. Nati 475, 222-225 (2011).

50. Munn, DH & Cheung, NK Fagositoz nan selil timè pa monosit imen kiltive nan makrofaj recombinant koloni-estimile faktè. J. Exp. Med. 172, 231–237 (1990).

51. Jadus, MR et al. Makwofaj yo touye selil timè gliyom T9 ki gen izofòm manbràn nan faktè estimile koloni makrofaj atravè yon chemen ki depann de fagositoz. J. Immunol. 160, 361–368 (1998).

52. Zhou, X., Liu, X. & Huang, L. Macrophage-medyatè fagositoz selil timè: yon opòtinite pou entèvansyon nanomedsin. Adv. Fonksyon. Mater. 31, 2006220 (2021).

53. Lecoultre, M., Dutoit, V. & Walker, PR fonksyon fagositik nan makrofaj timè ki asosye kòm yon detèminan kle nan kontwòl pwogresyon timè: yon revizyon. J. Immunother. Kansè 8, e001408 (2020).

54. Cui, S., Reichner, JS, Mateo, RB & Albina, JE Makwofaj murin aktive pwovoke apoptoz nan selil timè yo atravè mekanis ki depann de oksid nitrique oswa endepandan. Kansè Res. 54, 2462–2467 (1994).

55. Brahmer, JR et al. Sekirite ak aktivite antikò anti-PD-L1 nan pasyan ki gen kansè avanse. N. Engl. J. Med. 366, 2455–2465 (2012).

56. Saijo, S. et al. Dectin-1 obligatwa pou defans lame kont Pneumocystis carinii men se pa kont Candida albicans. Nat. Imunol. 8, 39–46 (2007).

57. Bernhagen, J. et al. Pirifikasyon, byoaktivite, ak analiz estrikti segondè sourit ak moun macrophage migration inhibitory factor (MIF). Byochimik 33, 14144-14155 (1994).

58. Chen, TJ & Kotecha, N. Cytobank: bay yon platfòm analytics pou analiz done sitometri kominotè ak kolaborasyon. Curr. Top. Microbiol. Imunol. 377, 127–157 (2014).

59. Nowicka, M. et al. Flux travay CyTOF: dekouvèt diferans nan seri done sitometri ki gen gwo dimansyon. F1000Res. 6, 748 (2017).

60. Wilkerson, MD & Hayes, DN ConsensusClusterPlus: yon zouti dekouvèt klas ak evalyasyon konfyans ak swiv atik. Bioinformatics 26, 1572-1573 (2010). 61. Finak G., JM FlowWorkspace: Enfrastrikti pou reprezante ak kominike avèk seri done cytometry gated ak ungated. Bioconductor vèsyon (2019).

62. Finak, G., Jiang, W. & Gottardo, R. CytoML pou pataje done sitometri kwa-platfòm. Cytom. Pati A: J. Int. Soc. Anal. Cytol. 93, 1189–1196 (2018).

63. Crowell, HL, Zanotelli, VRT, Chevrier, S. & Robinson, MD CATALYST: zouti analiz done sitometri. R pake vèsyon 1.10.3. HelenaLC/CATALYST (2020).

64. Cock, PJ, Fields, CJ, Goto, N., Heuer, ML & Rice, PM Fòma fichye Sanger FASTQ pou sekans ak nòt kalite, ak varyant Solexa/Illumina FASTQ. Asid Nukleik Res. 38, 1767–1771 (2010).

65. Illumina. Gid Itilizatè BaseSpace. 2014.

66. Andrews, S. FastQC: yon zouti kontwòl kalite pou done sekans debi segondè.

67. Dobin, A. et al. STAR: ultrarapid inivèsèl RNA-seq aligner. Bioinformatics 29, 15-21 (2013).

68. Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Modere estimasyon chanjman pliye ak dispèsyon pou done RNA-seq ak DESeq2. Genomic Biol. 15, 550 (2014).

69. Trapnell, C. et al. Jèn diferans ak analiz ekspresyon transkripsyon eksperyans RNAseq ak TopHat ak Cufflinks. Nat. Pwotok. 7, 562–578 (2012).

70. Anders, S., Pyl, PT & Huber, W. HTSeq–yon fondasyon Python pou travay ak done sekans gwo-debi. Bioinformatics 31, 166-169 (2015).

71. Boyle, EI et al. GO::TermFinder – lojisyèl sous louvri pou jwenn aksè nan enfòmasyon Gene Ontology ak jwenn tèm Gene Ontology ki anrichi anpil ki asosye ak yon lis jèn. Bioinformatics 20, 3710-3715 (2004).

72. Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: ansiklopedi kyoto nan jèn ak jenom. Asid Nukleik Res. 28, 27–30 (2000).

73. Stuart, T. et al. Entegrasyon konplè nan done sèl-selil. Selil 177, 1888–1902. e1821 (2019).

74. Lun, AT, Riesenfeld, S., Andrews, T., Gomes, T. & Marioni, JC EmptyDrops: distenge selil ki soti nan ti gout vid nan done sekans RNA sèl selil ki baze sou ti gout. Genomic Biol. 20, 1–9 (2019).

75. Hafemeister, C. & Satija, R. Nòmalizasyon ak estabilizasyon divèjans nan done sèl-selil RNA-seq lè l sèvi avèk regrezyon binomyal negatif regilarize. Genomic Biol. 20, 1–15 (2019).

76. Becht, E. et al. Rediksyon dimansyon pou vizyalize done yon sèl selil lè l sèvi avèk UMAP. Nat. Biotechnol. 37, 38–44 (2019).

77. Diaz-Mejia, JJ et al. Evalyasyon metòd pou asiyen etikèt kalite selil nan gwoup selil ki soti nan done sekans RNA yon sèl selil. F1000Res. 8 ISCB Comm J-296 (2019). 78. Hänzelmann, S., Castelo, R. & Guinney, J. GSVA: analiz varyasyon seri jèn pou done microarray ak RNA-seq. BMC Bioinforma. 14, 7 (2013).

79. Finak, G. et al. MAST: yon kad estatistik fleksib pou evalye chanjman transkripsyon ak karakterize eterojenite nan done sekans RNA yon sèl selil. Genomic Biol. 16, 1–13 (2015).

80. Suffiotti, M., Carmona, SJ, Jandus, C. & Gfeller, D. Idantifikasyon selil lenfoyid natirèl nan done sèl-selil RNA-Seq. Imunogenetics 69, 439-450 (2017).

81. Entwistle, LJ et al. Gwoup pulmonè 2 fenotip selil lenfoyid natirèl se kontèks espesifik: detèmine efè souch, kote, ak stimuli. Devan. Imunol. 10, 3114 (2020).

82. Ricardo-Gonzalez, RR et al. Siyal tisi anprint idantite ILC2 ak fonksyon antisipatwa. Nat. Imunol. 19, 1093–1099 (2018).

83. Zilionis, R. et al. Transcriptomic yon sèl selil nan kansè nan poumon imen ak sourit revele popilasyon myeloid konsève atravè moun ak espès yo. Iminite 50, 1317–1334.e1310 (2019).

Rekonesans

Otè yo vle remèsye Dr Wolfgang Zacharias, Dr Mei Zhang, ak Sabine Waigel ki soti nan Brown Cancer Center Genomics Facility pou èd yo nan RNA-Seq ak scRNASeq. Nou ta renmen remèsye Doktè Clint Geller tou pou koreksyon maniskri a. Travay sa a te sipòte pa NIH R01CA213990 ak R01AI128818 (JY). CD ak CTW te sipòte an pati pa NIH P20GM135004 la. Yon pati nan travay sa a te fèt avèk asistans UofL Genomics Facility, ki sipòte pa NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence), Brown Cancer Center, ak frè itilizatè yo. CyTOF te fèt nan Fonksyonèl Immunomic Core ki te sipòte pa NIH P20GM135004 (Jun Yan/Jason Chesney, MPI). NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) ak NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI) te bay sipò sekans ak byoenfòmatik pou travay sa a. Kontni travay sa a se responsablite sèlman otè yo epi yo pa reprezante opinyon ofisyèl NIH oswa Enstiti Nasyonal pou Syans Medikal Jeneral (NIGMS).

Kontribisyon otè

AEG te fèt ak fè eksperyans yo analize done, entèprete rezilta yo, epi ekri maniskri a. RS, CD, ak HG kontribye nan konsepsyon eksperimantal, akizisyon done, ak analiz done. MRW, XH, ak MZ ede nan akizisyon done ak preparasyon materyèl yo. KA ak ECR kontribye nan analiz enfòmatik ak entèpretasyon analiz RNA-Seq ak JHC ak ECR kontribye nan analiz enfòmatik ak entèpretasyon analiz ScRNA-Seq. DT ak CTW kontribye nan analiz done CyTOF yo. RAM, H.-gZ, ak YL kontribye materyèl ak gide pwojè a. RAM fè yon revizyon kritik. JY te dirije konsepsyon eksperimantal ak etid la an jeneral, entèprete done, rechèch sipèvize, epi ede nan ekri ak revizyon maniskri a.

Enterè konpetisyon

Otè yo pa deklare okenn enterè konpetisyon.

Lòt enfòmasyon

Enfòmasyon siplemantè Vèsyon sou entènèt la gen materyèl siplemantè ki disponib nan https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4.

Korespondans ak demann pou materyèl yo ta dwe adrese bay Jun Yan.

Enfòmasyon sou revizyon parèy yo

Nature Communications remèsye George Miller ak lòt evalè ki anonim yo pou kontribisyon yo nan revizyon kanmarad travay sa a. Rapò evalyatè kanmarad yo disponib.

Reprint ak enfòmasyon sou pèmisyon yo disponib nan http://www.nature.com/reprints

Nòt Piblikatè Springer Nature rete net sou reklamasyon jiridiksyon nan kat pibliye ak afilyasyon enstitisyonèl.

Aksè Lib Atik sa a gen yon lisans Creative Commons Attribution 4.0 Entènasyonal Lisans, ki pèmèt itilizasyon, pataje, adaptasyon, distribisyon, ak repwodiksyon nan nenpòt mwayen oswa fòma, toutotan ou bay otè orijinal la kredi apwopriye. (s) ak sous la, bay yon lyen ki mennen nan lisans Creative Commons, epi endike si yo te fè chanjman.

Imaj yo oswa lòt materyèl twazyèm pati nan atik sa a enkli nan lisans Creative Commons atik la sof si yo endike otreman nan yon liy kredi nan materyèl la. Si materyèl pa enkli nan lisans Creative Commons atik la epi itilizasyon ou gen entansyon pa otorize pa règleman lalwa oswa depase itilizasyon otorize a, w ap bezwen jwenn pèmisyon dirèkteman nan detantè copyright la. Pou wè yon kopi lisans sa a.

For more information:1950477648nn@gmail.com