Disregulation RNA eleman transposab nan mutan KRAS(G12C) 3D esferoid kansè nan poumon
Oct 27, 2023
REZIME
KRAS mutan kontwole RNA eleman transposab (TE) ak ekspresyon jèn entèferon-stimulé (ISG), men li rete klè si divès mitasyon nan KRAS afekte diferan TE RNA nan tout genòm nan. Nou analize transkriptòm 3D esferoid kansè nan poumon imen ki gen mitasyon KRAS (G12C) pou detèmine peyizaj TE RNAs ki reglemante pa mutan KRAS (G12C). Nou te jwenn ke KRAS (G12C) siyal obligatwa pou ekspresyon de LINE- ak LTR-sòti TE RNAs ki diferan de TE RNAs deja montre yo dwe reglemante pa mutan KRAS (G12D) oswa KRAS (G12V). Anplis, KRAS(G12C) anpèchman espesyalman upregulates SINE-sòti TE RNAs ki soti nan pi piti Alu subfamily AluY. Rezilta nou yo revele ke disregulasyon TE RNA nan selil kansè nan poumon ki baze sou KRAS yo depann de mitasyon, pandan y ap mete aksan sou yon ti gwoup jèn TE RNA ki sòti nan Alu ki kowòdoneman aktive ak jèn iminite natirèl sou anpèchman KRAS(G12C).
Benefis cistanche tubulosa-Antitumor
ENTWODIKSYON
RNAs eleman transposab (TE) yo kontinye deregleman nan yon kontèks kansè nan 1. Nan selil kansè nan poumon KRAS mutan yo, jèn KRAB zenk-finger (KZNF) yo lajman downregulated, ki mennen nan regilasyon aberan nan RNAs TE ki sòti nan LINE, SINE, ak Eleman LTR 2,3. Anplis TE RNAs, RNAs long noncoding (lncRNAs) yo tou kowòdone reglemante ak jèn siyal RAS 4, epi modèl ekspresyon yo chanje menm jan an nan anpil kansè 5-8. Pou TE RNAs, upregulation yo nan kansè pwovoke yon eta de mimicry viral, ki mennen nan aktivasyon an intrinsèques nan jèn iminite natirèl tankou jèn entèferon-stimulated (ISGs) 3,9,10. An patikilye, fanmi an Alu nan SINE yo se yon sous dominan nan imunojèn TE RNAs 11, ki pwovoke pa chanjman epigenetik ki te koze pa inibitè ADN methyltransferase (DNMTi) oswa mutan KRAS-medyatè anpèchman KZNF 3,9,10.
Pou mennen ankèt sou fason yon mitasyon komen nan KRAS afekte jaden flè TE RNA nan selil kansè nan poumon, nou karakterize transcriptom yo nan esferoyid kansè nan poumon 3D ki gen mitasyon KRAS (G12C) nan prezans oswa absans mutan KRAS (G12C) inhibiteur 12. Nou montre ke KRAS(G12C) siyal obligatwa pou ekspresyon de LINE ak LTR ki sòti TE RNAs, pandan y ap KRAS (G12C) anpèchman espesyalman upregulates tou de SINE ki sòti TE RNAs ak yon ti gwoup entèferon (IFN) ki gen rapò ak jèn. Konklizyon nou yo revele entèraksyon konplèks ant siyal KRAS mutan ak disregulasyon TE nan selil kansè nan poumon, kote yon seri eleman jèn AluY yo reglemante nan yon fason ki depann de mitasyon.
Benefis cistanche tubulosa-Antitumor
REZILTA
Anpèchman KRAS(G12C) chanje transcriptom kodaj ak nonkodaj
Pou detèmine kijan siyal onkogenik KRAS(G12C) kontwole transcriptom kodaj ak nonkodaj, nou te fè sekans RNA (RNA-seq) sou sferoid kansè nan poumon 3D mutan KRAS(G12C). Pou RNA-seq, nou te itilize yon pwotokòl tout longè ak 5' idantifyan molekilè inik (UMI) pou pèmèt konte RNA egzak pandan y ap diminye patipri anplifikasyon PCR 13 (Figi 1A). Nou te konpare transkriptòm esferoyid kansè nan poumon H358 yo trete ak inibitè KRAS(G12C) ARS-1620 (ARS) pou kontwole esferoyid yo (trete DMSO) (Figi S1A) epi nou te wè tretman ARS te redwi anpil nivo ERK fosforilate. (p-ERK) (Figi S1B), ki endike ke tretman ARS te anpeche en KRAS (G12C) siyal. Suppression nan siyal KRAS (G12C) pa tretman ARS te pwouve tou pa rediksyon nan gwosè spheroid ak viabilite selil (Figi S1C ak S1D).
Nan nivo RNA, nou evalye abondans relatif yo nan byotip diferan ak superfamilies TE nan esferoid kansè nan poumon 3D trete ARS oswa DMSO, ki revele chanjman dinamik nan konpozisyon TE RNA sou anpèchman KRAS (G12C) (Figi 1B). Pandan ke nou detekte sèlman 32% nan GENCODE-anote jèn pwoteyin-kode ak 15% nan jèn lncRNA, 92-96% nan superfamilies TE (92% LTR, 95% SINE, 96% LINE) te reprezante nan UMI-tagged nou an. Done RNA-seq, ki revele gwo disregulasyon nan TE RNAs nan transkriptòm KRAS(G12C)-kondwi. Jiska yon ka nan tout molekil RNA detekte nan esferoid kansè nan poumon ki trete ARS yo te sòti nan TE, sa ki endike ke TE RNA reprezante yon pòsyon konsiderab nan pwodiksyon transkripsyon selil kansè nan poumon KRAS (G12C) mutan yo.
benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè
Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity
【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Apre sa, nou te detèmine jèn ki eksprime siyifikativman diferans ant esferoid kansè nan poumon 3D trete ARS ak DMSO pou idantifye pwosesis byolojik ki te kontwole pa siyal onkogenik KRAS(G12C). Esferoid kansè nan poumon ak siyal KRAS (G12C) entak yo te siyifikativman anrichi pou jèn ki enplike nan pòs G2M, objektif E2F, objektif MYC, ak file mitotik (Figi 1C). Lè KRAS (G12C) anpèchman, sepandan, esferoid kansè nan poumon eksprime nivo siyifikativman pi wo nan jèn ki enplike nan fosforilasyon oksidasyon, konpleman, ak repons IFN alfa ak gamma (Figi 1C), bay plis prèv sipò pou patisipasyon nan siyal KRAS nan règleman an. nan jèn ki gen rapò ak IFN 2,3.
KRAS (G12C) anpèchman kowòdone pwovoke ISG yo ak jèn eleman AluY
Pou plis elicide regilasyon intrinsèque ISG yo sou anpèchman KRAS (G12C), nou idantifye ki jèn ak TE yo te eksprime siyifikativman diferan nan chak seri jèn ak superfami TE, respektivman. Nan tou de jèn repons IFN alfa ak IFN gamma, jèn ki pi fòtman pwovoke sou anpèchman KRAS (G12C) nan esferoyid kansè nan poumon se te RTP4 (Figi 2A), yon pwoteyin transpòtè reseptè ki kontwole negatif siyal TBK1 14. Anplis de sa, MHC klas I konplèks la. jèn beta-2-mikroglobulin (B2M), ki se inaktive frekans nan kansè nan poumon 15, te tou siyifikativman upregulated nan tou de seri jèn ki gen rapò ak IFN nan esferoid kansè nan poumon trete ARS (Figi 2A).
Bay wòl dirèk pou siyal onkogenik KRAS nan règleman TE RNA 3, nou te envestige ki soufanmi TE RNA yo te depann de mutan KRAS (G12C). Nan esferoid kansè nan poumon ak siyal KRAS (G12C) entak, nou te jwenn ke subfamilies LINE L1M6B ak L1PA12 yo te trè eksprime ak depann sou KRAS (G12C), jan sa pwouve pa downregulation yo nan esferoid kansè nan poumon trete ak ARS (Figi 2B). Anplis, pandan yon sèl soufanmi ADN MER44D te depann de siyal KRAS(G12C), plis pase yon douzèn soufanmi LTR te kontwole pa mutan KRAS(G12C), ki gen ladan MLT1A0-int, LTR51, MER50B. , ak LTR1B0 (Figi 2B). Kontrèman, tout subfamilies SINE yo te siyifikativman regilasyon sou anpèchman KRAS (G12C) ak kowòdoneman pwovoke ak jèn ISG espesifik (Figi 2A) nan esferoid kansè nan poumon. SINE TE RNAs sa yo tout te sòti nan subfami AluY (Figi 2B), ki endike ke KRAS (G12C) anpèchman dysregulates yon sous-ensemble espesifik nan eleman AluY jenn.
KRAS (G12C) anpèchman downregulates long noncoding RNAs
Pou plis elicide efè KRAS (G12C) anpèchman sou transcriptome a, nou egzamine tout lncRNAs siyifikativman diferansye eksprime nan esferoid kansè nan poumon trete ak ARS oswa DMSO kontwòl. Nou te jwenn ke yon gwo kantite lncRNAs te depann sou KRAS (G12C) siyal pou ekspresyon yo, kòm anpil nan lncRNAs sa yo te siyifikativman downregulated sou KRAS (G12C) anpèchman (Figi 3A). Twa nan lncRNAs downregulated sa yo, AC114546.3, NCMAP-DT, ak AC073575.2, pa gen okenn fonksyon li te ye men sipèpoze nan yon oryantasyon antisans nan kodaj jèn yo ZNF770, RCAN3, ak ERP29, respektivman. Kòm yon klas nan RNA ki pa kodaj, nou obsève gwo downregulation nan lncRNAs sou tretman ARS nan esferoyid kansè nan poumon (Figi 3B), ki endike ke anpil lncRNA yo depann sou KRAS (G12C) siyal pou ekspresyon yo.
benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè
DISKISYON
Isit la nou montre ke siyal onkogenik KRAS(G12C) obligatwa pou ekspresyon de superfamilies TE espesifik, sètadi eleman LINE ak LTR, osi byen ke yon sou-ansanm lncRNAs, plis demontre ki jan siyal RAS kontwole transcriptome ki pa kodaj 2-4. Nou menm tou nou te itilize yon modèl esferoid kansè nan poumon 3D pou eksperyans inibitè KRAS(G12C) nou yo depi ke modèl 3D yo te montre yo plis fidèlman rezime repons nan dwòg in vivo lè yo konpare ak modèl kilti 2D 16. Anplis de sa, aplikasyon nou an nan yon UMI ki baze sou plen. -length RNA-seq teknik 13 te pèmèt nou pran plis presizyon konpozisyon TE RNA ak dinamik nan esferoid kansè nan poumon nou yo lè nou retire kopi PCR nan done RNA-seq nou an.
Konklizyon nou yo ki konsistan avèk etid anvan yo nan anpèchman KRAS (G12C), kote IFN alfa ak jèn repons gama yo te regilasyon nan selil kansè nan poumon H358 ki trete ARS 17. Ki baze sou pwopriyete iminojenik li te ye nan RNAs Alu ki sòti 11, rezilta nou yo sijere ke regilasyon espesifik nan jèn eleman AluY sou anpèchman KRAS(G12C) se omwen an pati responsab pou regilasyon fò nan ISG nan esferoid kansè nan poumon trete ARS. Miyò, anrichisman enpòtan nan jèn ki gen rapò ak IFN an repons a tretman inhibitor KRAS (G12C) pa gen ladan plis regilasyon nan ISG Capteur RNA tankou MDA-5, RIG-I, oswa PKR, ki okòmansman vin regilasyon nan selil nan poumon an repons a siyal onkogenik KRAS 2,3.
Nou te deja montre ke mutant KRAS siyal pou kont li ase pou pwovoke TE RNA upregulation nan selil nan poumon moun ki te transfòme nan vitro 2,3, ak rezilta nou yo dekri isit la pwolonje obsèvasyon sa yo nan selil kansè nan poumon ak yon diferan aktive mitasyon KRAS. KRAS(G12D) oswa KRAS(G12V) mitasyon tou de pwovoke siyifikatif upregulation nan subfami LTR12C nan transfòme selil poumon 3, men nou pa t 'wè siyifikatif anrichisman nan LTR12C-sòti TE RNAs nan esferoid kansè nan poumon KRAS (G12C) nou an. Olye de sa, nou te wè regilasyon LTR51, LTR1B0, LTR14B, ak LTR28B, ki sijere ke divès mitasyon genyen-of-fonksyon nan KRAS kontwole diferan aspè nan transkriptom TE RNA a.
Travay nou an bay yon evalyasyon konplè sou fason transcriptome noncoding/TE RNA reponn dinamikman a anpèchman KRAS (G12C). Etid nan lavni yo ka bay nouvo apèsi sou wòl potansyèl noncoding/TE RNAs nan mekanis rezistans inhibitor KRAS (G12C). Anplis de sa, TE RNAs ki sekrete nan selil kansè yo lè KRAS anpèchman ka sèvi kòm biomake RNA ekstraselilè 2,3,5,18,19 nan repons ak/oswa rezistans nan terapi inhibiteur KRAS 20.
MATERYÈL AK METÒD
Liy selilè
Liy selil kansè nan poumon H358 ki gen mitasyon KRAS(G12C) yo te kiltive nan mwayen RPMI 1640 (Invitrogen) ki te konplete ak 10% serom fetis bovin (Sigma) nan 37 degre, 5% CO2 nan yon enkibatè imidite. Tout liy selil yo te teste negatif pou mycoplasma. Liy selilè yo te achte nan men American Type Culture Collection (ATCC).
Esay viabilite selil yo
Pou tès viabilite spheroid, yo te simen 10,000 selil/byen nan plak ki ba adezyon wonn anba 96-byen epi yo te enkube a 37 degre, 5% CO2 pou 24 èdtan. Lè sa a, seri dilye ARS- 1620 oswa DMSO yo te ajoute nan selil yo, ak plak yo te enkube nan kondisyon kilti estanda pou 72 èdtan, ak fre ARS ak DMSO medya yo te ranplase chak jou. Vitabilite selil yo te mezire lè l sèvi avèk yon twous tès Cell Titer-Glo® Luminescent Cell Viability (Promega) dapre pwotokòl manifakti a. Siyal luminesans echantiyon ARS trete yo te nòmalize nan kontwòl DMSO. Luminesans yo te mezire sou yon aparèy molekilè SpectraMax iD3.
izolasyon RNA
Yo te izole total de RNA esansyèl nan apeprè 100 esferoid H358 (pa kondisyon) lè l sèvi avèk Quick-RNA Mini-Prep kit (Zymogen) dapre pwotokòl manifakti a. Yo te mezire RNA atravè NanoDrop-8000 Spectrophotometer.
Preparasyon bibliyotèk RNA-seq
Yo te itilize yon pwotokòl Smart-seq3 adapte 13 pou jenere bibliyotèk RNA-seq soti nan RNA total pou konte ak evalye molekil RNA tout longè. Yon ti tan, yo te transkri 10ng total de RNA lè l sèvi avèk yon premye oligoDT kòd bar (125nM) ki te swiv pa chanje modèl ak yon oligo switch modèl barcoded (125nM). Sekans oligo sa yo te sèvi kòm primè pou anplifikasyon PCR. Twous Nextera HT (Illumina) te itilize pou konvèti bibliyotèk cDNA nan bibliyotèk sekans ak adisyon nan yon Jadendanfan UMI-espesifik pou anplifye pwent cDNA ki gen kòd bar molekilè jan sa dekri nan pwotokòl Smart-seq3 la. cDNA ak bon jan kalite bibliyotèk yo te evalye lè l sèvi avèk yon chip ADN bioanalyzer Agilent ki gen gwo sansiblite epi yo te mezire lè l sèvi avèk tès ADN ki gen gwo sansiblite sou Qubit 3.0 la.
Lwès blòt
Apeprè 100 esferoid H358 (pa kondisyon) te izole apre tretman ARS oswa DMSO. Lè sa a, esferoyid yo te enkube sou glas nan tanpon RIPA complétée ak inibitè proteaz pou 15 minit. Lè sa a, Lysates yo te file nan 10,000 RCF pou 10 minit. Lè sa a, supernatant te transfere nan yon tib nouvo pou preparasyon echantiyon SDS-PAGE ki vin apre nan tanpon Laemmli, bouyi pou 5 minit nan 95 C pou yon konsantrasyon final 1mg / ml. SDS PAGE te fèt pou separe pwoteyin pa gwosè ki te swiv pa transfè ki vin apre nan yon manbràn PVDF. Manbràn yo te enkube ak antikò prensipal p-ERK (CST) ak HSP90 (CST) lannwit lan nan 4 C. Lè sa a, antikò segondè (Abcam) yo te enkube sou 3 fwa TBST lave manbràn nan bloke tanpon pou D 'ki vin apre.
benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè
UMI deduplication
Lekti fen illuminasyon pè yo te koupe adaptè lè l sèvi avèk FastP 21 ak paramèt default. Yo te retire UMI yo nan lekti a epi yo te deplase nan non li yo lè l sèvi avèk umi_zouti_extrè ki soti nan pake zouti UMI 22 la ak modèl kòd bar yo mete sou "NNNNNNNN". Lekti yo retire UMI yo te aliyen kont HG38 lè l sèvi avèk aliyman STAR la ak seri anotasyon GENCODE v38 la. Lekti ki aliyen yo te deduplike lè l sèvi avèk "UMI-tools dedup" ak paramèt default yo.
Analiz RNA-seq
Tout fichye fastq yo te taye ak Trimmomatic 2 (0.38) 23 epi yo te evalye fichye yo taye ki te lakòz yo ak FastQC 24 epi yo te trete yo ak tiyo analitik sa a: Salmon (1.3.0): pseudoalignment RNA. lekti -seq fèt ak Salmon 25 lè l sèvi avèk agiman sa yo: {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphans --rangeFactorizationBins 4 lè l sèvi avèk yon endèks ki te kreye nan GENCODE vèsyon 35 transcriptome fasta dosye a lè l sèvi avèk sekans dekoy pou pèmèt aliyman selektif. Yo te kreye yon endèks adisyonèl ki konsyan de TE nan yon fason menm jan an men li te konplete ak sekans ki te pwodwi nan track UCSC Repeat Masker. DESeq2 (1.32.0): Yo te enpòte pwodiksyon somon nan yon objè DESeq lè l sèvi avèk tximport 26 epi yo te fè analiz ekspresyon diferans ak agiman estanda 27. Yo te filtre tout rezilta yo pou yo gen padj <0.05. Kote done konte yo te itilize, li te nòmalize atravè echantiyon yo itilize DESeq.
Gene seri anrichisman analiz
Jèn ki eksprime diferan yo te klase pa valè log2FoldChange ki te retresi ki te pwodwi pa DESeq2. Ansanm jèn yo te akeri lè l sèvi avèk pake R msigdbr (7.4.1) epi yo te filtre pou sèlman genyen seri jèn ak estati 'Hallmark'. Pake R fgsea (1.18.0) yo te itilize pou jenere estimasyon anrichisman Gene Set ki te filtre pou rezilta ak pvalues ajiste <{8}}.05.
REFERANS
1. Burns, KH (2017). Eleman transposable nan kansè. Nat Rev Kansè 17, 415-424. 10.1038/nrc.2017.35.
2. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L., Kim, E., Malik, S., Fernandes, J., et al. (2020). Reprogramasyon epigenomik nan RNAs ki pa kodaj repetitif ak jèn ki ankouraje IFN pa mutan KRAS. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.
3. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Hrabeta-Robinson, E., Behera, A., Peddu, V., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L. ., et al. (2022). KRAS mutan kontwole eleman transposable RNA ak iminite natirèl atravè jèn zenk-dwèt KRAB. Rapò selilè 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.
4. Kim, DH, Marinov, GK, Pepke, S., Singer, ZS, Li, P., Williams, B., Schroth, GP, Elowitz, MB, ak Wold, BJ (2015). Analiz transcriptome sèl-selil revele chanjman dinamik nan ekspresyon lncRNA pandan repwogram. Selil Stem Selil 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.
5. Reggiardo, RE, Maroli, SV, ak Kim, DH (2022). LncRNA Biomarkers nan enflamasyon ak kansè. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.
6. Schmitt, AM, ak Chang, HY (2016). Long Noncoding RNAs nan chemen kansè yo. Selil Kansè 29, 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010.
7. Rinn, JL, ak Chang, HY (2020). Long Noncoding RNAs: Modalite molekilè nan fonksyon òganis. Annu Rev Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biochem- 062917-012708.
8. Slack, FJ, ak Chinnaiyan, AM (2019). Wòl RNA ki pa kode nan nkoloji. Selil 179, 1033-1055. 10.1016/j.cell.2019.10.017.
9. Chiappinelli, Katherine B., Strissel, Pamela L., Desrichard, A., Li, H., Henke, C., Akman, B., Hein, A., Rote, Neal S., Cope, Leslie M. , Snyder, A., et al. (2015). Anpeche metilasyon ADN lakòz yon repons entèferon nan kansè atravè dsRNA ki gen ladan retroviris andojèn. Selil 162, 974-986. 10.1016/j.cell.2015.07.011.
10. Roulois, D., Loo Yau, H., Singhania, R., Wang, Y., Danesh, A., Shen, Shu Y., Han, H., Liang, G., Jones, Peter A., Pugh, Trevor J., et al. (2015). Ajan Demethylating ADN yo vize selil kansè kolorektal yo lè yo pwovoke mimik viral pa transkripsyon andojèn yo. Selil 162, 961-973. 10.1016/j.cell.2015.07.056.
11. Mehdipour, P., Marhon, SA, Ettayebi, I., Chakravarthy, A., Hosseini, A., Wang, Y., de Castro, FA, Loo Yau, H., Ishak, C., Abelson, S. ., et al. (2020). Terapi epijenetik pwovoke transkripsyon SINEs envèse ak depandans ADAR1. Nature 588, 169-173. 10.1038/s41586-020-2844-1.
12. Ostrem, JM, Peters, U., Sos, ML, Wells, JA, ak Shokat, KM (2013). K-Ras (G12C) inhibiteurs allosterically kontwole GTP afinite ak efèktè entèraksyon. Nature 503, 548- 551. 10.1038/nati12796.
13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR, ak Sandberg, R. (2020). RNA yon sèl selil konte nan alèl ak rezolisyon izofòm lè l sèvi avèk Smart-seq3. Nat Biotechnol 38, 708-714. 10.1038/s41587-020- 0497-0.
14. Li, X., Ashbrook, AW, Du, Y., Wu, J., Hoffmann, HH, Zhang, C., Xia, L., Peng, YC, Tumas, KC, Singh, BK, et al. (2020). RTP4 inibit repons IFN-I ak amelyore eksperimantal malarya serebral ak neropatoloji. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/pnas.2006492117.
15. Pereira, C., Gimenez-Xavier, P., Pros, E., Pajares, MJ, Moro, M., Gomez, A., Navarro, A., Kapòt, E., Moran, S., Gomez- Lopez, G., et al. (2017). Genomic Profiling nan Pasyan Derive Xenografts pou kansè nan poumon Idantifye inaktivasyon B2M ki afekte iminorekognisyon. Clin Cancer Res 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.
16. Sen, C., Freund, D., ak Gomperts, BN (2022). Modèl ki genyen twa dimansyon nan poumon an: sot pase, prezan ak lavni: yon revizyon mini. Biochem Soc Trans 50, 1045-1056. 10.1042/BST20190569. 17. Mugarza, E., van Maldegem, F., Boumelha, J., Moore, C., Rana, S., Llorian Sopena, M., East, P., Ambler, R., Anastasiou, P., Romero -Clavijo, P., et al. (2022). Terapetik KRAS (G12C) anpèchman kondwi efikas iminite entèferon-medyatè antitumoral nan kansè nan poumon imunojèn. Sci Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.
18. Khojah, R., Reggiardo, RE, Ozen, M., Maroli, SV, Carrillo, D., Demirci, U., ak Kim, DH (2022). Siyati RNA ekstraselilè selil mutan KRAS(G12C) adenokarcinom nan poumon. bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.
19. Wang, J., Ma, P., Kim, DH, Liu, BF, ak Demirci, U. (2021). Nan direksyon izolasyon eksozòm ki baze sou mikrofluidik ak deteksyon pou terapi timè. Nano Jodi a 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.
20. Moore, AR, Rosenberg, SC, McCormick, F., ak Malek, S. (2021). Terapi ki vize RAS. Nat Rev Drug Discov. 10.1038/s41573-021-00220-6.
21. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., ak Gu, J. (2018). fastp: yon ultra-rapid tout-an-yon preproseseur FASTQ. Bioenfòmatik 34, i884-i890. 10.1093/bioinformatics/bty560.
22. Smith, T., Heger, A., ak Sudbery, I. (2017). UMI-zouti: modèl sekans erè nan Idantifyan Molekilè Inik pou amelyore presizyon quantification. Genomic Res 27, 491- 499. 10.1101/gr.209601.116.
23. Bolger, AM, Lohse, M., ak Usadel, B. (2014). Trimmomatic: yon régler fleksib pou done sekans Illumina. Bioenfòmatik 30, 2114-2120. 10.1093/bioinformatics/btu170.
24. Brown, J., Pirrung, M., ak McCue, LA (2017). FQC Dashboard: entegre rezilta FastQC nan yon zouti kontwòl kalite FASTQ ki baze sou entènèt, entèaktif, ak extensible. Bioenfòmatik. 10.1093/bioinformatics/btx373.
25. Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, ak Kingsford, C. (2017). Salmon bay yon kantite rapid ak konsyan de patipri ekspresyon transkripsyon an. Nat Metòd 14, 417-419. 10.1038/nmeth.4197.
26. Soneson, C., Love, MI, ak Robinson, MD (2015). Analiz diferans pou RNA-seq: estimasyon nivo transkripsyon amelyore enferans nivo jèn yo. F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000research.7563.2.
27. Love, MI, Huber, W., ak Anders, S. (2014). Estimasyon modere chanjman pliye ak dispèsyon pou done RNA-seq ak DESeq2. Genome Biol 15, 550. 10.1186/s13059-014- 0550-8.
REKONÈS
Nou remèsye manm Kim Lab pou diskisyon itil. Travay sa a te sipòte pa lajan ki soti nan Baskin School of Engineering (bay DHK). DC te sipòte pa yon Prim Fellowship Predoctoral nan Pwogram Rechèch Maladi Tabak (T30DT0997), RER te sipòte pa yon F99/K00 NIDDK KUH Prim Tranzisyon Kamarad Predoktoral nan Postdoktoral nan Enstiti Nasyonal Sante (1F99DK{). {7}}), ak VP te sipòte pa yon Prim Predoctoral Fellowship nan Pwogram Rechèch Maladi Tabak (T32DT4904).
KONTRIBYON OTÉ
DHK te konseptyalize rechèch, DC ak DHK fèt rechèch, DC, JL, ak GM fè eksperyans, RER ak VP analize done, epi DC ak DHK te ekri papye a ak opinyon otè yo.
FIIG
Figi 1. KRAS(G12C) anpèchman chanje transcriptome kodaj ak nonkodaj A. Chema eksperimantal. B. Distribisyon konte yo asiyen nan GENCODE kodaj, lncRNA, ak TE/repete superfamilies nan ARS-trete (ars) oswa DMSO-trete (dmso) kansè nan poumon bibliyotèk spheroid RNA-seq, kote chak kolòn reprezante yon replike byolojik. C. Siyifikatif Gene Set Enrichment Analysis rezilta yo obsève nan DMSO-trete (adwat, pozitif NES) oswa ARS-trete (gòch, negatif NES) esferoid kansè nan poumon lè l sèvi avèk diferan eksprime jèn klase pa nòt anrichisman nòmalize (NES).
Figi 2. KRAS (G12C) anpèchman kowòdone pwovoke ISG yo ak jèn eleman AluY
A. Trase vòlkan ki montre ekspresyon diferans enpòtan yo obsève nan seri jèn kle ant esferoid kansè nan poumon trete DMSO (adwat, chanjman pozitif pliye) oswa ARS-trete (gòch, chanjman pli negatif). B. Trase vòlkan ki montre ekspresyon diferans enpòtan yo obsève nan superfamilies TE ant DMSO-trete (adwat, chanjman pli pozitif) oswa ARS-trete (gòch, negatif pliye-chanjman) esferoid kansè nan poumon.
Figi 3. KRAS (G12C) anpèchman downregulates long noncoding RNAs
A. Trase vòlkan nan ekspresyon diferans enpòtan nan RNAs GENCODE pwoteyin ki kode ak lncRNAs ant DMSO-trete (adwat, pozitif fold-chanjman) oswa ARS-trete (gòch, negatif fold-chanjman) esferoid kansè nan poumon. B. Bwat plot nan ekspresyon diferans enpòtan nan GENCODE pwoteyin-kode RNAs ak lncRNAs ant DMSO-trete (anwo, pozitif pliye-chanjman) oswa ARS-trete (anba, negatif pliye-chanjman) spheroids kansè nan poumon (Wilcoxon).
Figi siplemantè
Figi S1.
A. H358 3D esferoyid kansè nan poumon yo trete ak ARS oswa DMSO. B. Western blot pou p-ERK ak HSP90 lè l sèvi avèk esferoyid kansè nan poumon H358 3D trete ak ARS oswa DMSO. C. Mezi dyamèt (an mikwomèt) (trase gòch) ak viabilite selil (Cell Titer-Glo® viabilite selil luminesan nan inite fluoresans relatif) (trase adwat) nan esferoyid kansè nan poumon H358 3D trete ak ARS oswa DMSO apre 3 oswa 5 jou tretman (500 nM ARS-1620 oswa DMSO). D. Mezi dyamèt (an mikromèt) esferoyid kansè nan poumon H358 3D trete ak diferan konsantrasyon ARS-1620 (nM) pandan 7 jou.
