Etid sou efè kalsitriol anti-aje sou selil asasen natirèl imen an vitro

REZIME

Vitamin D lajman konsidere kòm gen yon efè regilasyon sou sistèm iminitè a. Gen kèk envestigasyon klinik yo te montre ke demann lan pouvitamin D ogmante ak laj. Calcitriol se fòm biyolojik aktif nanvitamin D. Sepandan, efè li sou selil moun ki asasen natirèl (NK) rete klè. Se poutèt sa, nan etid sa a, nou envestige efè anti-aje ak imunomodulatwa kalsitriol yo sou selil NK lè l sèvi avèk yon seri de metòd iminolojik yo eksplore wòl enpòtan li nan iminite natirèl. Nou te jwenn ke kalsitriol ranvèse ekspresyon biomarkers ki gen rapò ak aje nan selil NK ak inibit ekspansyon yo pa kenbe selil sa yo nan faz G1, san okenn apoptoz ak fatig. Calcitriol reprime liberasyon cytokin ki gen rapò ak enflamasyon, tankou interleukin-5 (IL{-5), interleukin-13 (IL{-13), interferon-gamma (IFN- ), ak faktè necrosis timè-alfa (TNF-). Degranulation nan selil NK te downregulated pa calcitriol lè selil sa yo te ko-kilti ak selil timè K562. Nou te jwenn tou ke kalsitriol te kontwole sirtuin 1- pwoteyin/kinaz R ki gen rapò ak aje kinaz retikul endoplasmik kinaz (SIRT1/pERK) ak ekspresyon SIRT1-deltaExon8 (SIRT1-∆Exon8) pa aktive reseptè vitamin D a (VDR). Anplis, calcitriol ta ka yon potansyèl regilatè negatif nan selil NKapoptozepiinaktivasyon mitokondriyoki koze paestrès oksidatif. Kidonk, montre kalsitriolefè anti-ajesou selil NK imen an vitro pa aktive SIRT1-PERK aks la akreziste senesans oksidatif.

Klike La a Pou Jwenn Sipleman Anti-aje Cistanche

1. Entwodiksyon

Anpil etid yo te jwenn ke aje egzèse yon enfliyans dirèk sou plizyè maladi, tankou maladi enfeksyon, maladi kadyovaskilè, maladi neurodegenerative, maladi otoiminitè, ak kansè. Aje òganis akonpaye pa iminosenescence. Karakteristik komen nan aje sitou gen ladan enflamasyon aje ak enflamasyon kwonik ki ba [1], enstabilite genomic, move balans ekspresyon pwoteyin, inaktivasyon mitokondriyo, senesans selilè, ak chanjman nan kominikasyon entèselilè [2]. Kòm eleman prensipal nan iminite natirèl, selil NK jwe yon wòl enpòtan nan efè anti-enfeksyon ak anti-timè ak règleman sistèm iminitè a [3]. Selil NK yo ka elimine selil sib yo dirèkteman oswa atravè sitotoksisite selilè ki depann de antikò (ADCC), olye pou yo montre nenpòt repons antijèn oswa antikò espesifik [4]. Selil NK yo asosye tou ak reyaksyon ipèsansibilite ak maladi otoiminitè [5]. Lè sistèm iminitè a vin gen laj, ekspresyon de reseptè aktivasyon sifas tankou asasen natirèl gwoup 2 manm D (NKG2D) [6], asasen imunoglobulin-tankou reseptè (KIR), sifas makè gwoup diferansyasyon 57 (CD57) [7] , yon gwoup diferansyasyon 16 (CD16) [8] ogmante. Molekil sa a ta ka aktive fonksyon an touye nan selil NK, ki ka mennen nan move balans selilè ak enflamasyon nan ansyen an. Pandan se tan, molekil inhibiteur nan selil NK tankou asasen natirèl gwoup 2 manm A (NKG2A), asasen natirèl gwoup 2 manm C (NKG2C), ak reseptè sitotoksisite natirèl (NCRs) [6] diminye. Lòt makè ki gen rapò ak aje nan selil NK yo se imunoglobulin selil T ak pwoteyin 3 ki gen domèn mucin (TIM3) ak lanmò selil pwograme -1 (PD-1) ogmante. Regilasyon nan PD-1 ak TIM3 pandan iminosenesans ka anpeche fonksyon selil NK yo epi mennen nan rediksyon selil NK [9].

Yon lòt faktè ki mennen nan iminosenescence se enflamasyon iminitè [10]. Yo rapòte nivo segondè nan sitokin enflamatwa ki pibliye pa selil NK yo lakòz domaj ADN, estrès oksidatif, ak senesans selil. Anplis, dezekilib selilè selil NK ak estati enflamasyon ka lakòz maladi otoiminitè [11]. Nivo entèleukin-1 (IL-1), entèleukin-4 (IL{-4), entèleukin-6 (IL-6), entèleukin -10 (IL-10), ak faktè necrosis timè-alfa (TNF-) pi wo nan granmoun aje [12]. Malgre ke kantite selil iminitè total diminye ak aje, popilasyon selil NK la te ogmante konsiderableman, ki ka koze pa enfiltrasyon selil enflamatwa [13].

Vitamin D egziste nan de fòm aktif nan kò imen an tankou vitamin D2 (ergocalciferol) ak vitamin D3 (calcitriol). Fonksyon prensipal vitamin D se ankouraje absòpsyon kalsyòm ak fosfò. Vitamin D tou kontwole fonksyon iminitè [14]. Malgre ke anpil rapò yo te konsantre sou fonksyon anti-enfeksyon ak anti-timè li yo [15], calcitriol montre efè anti-enflamatwa tou [16]. Reseptè vitamin D a (VDR) eksprime sou divès selil iminitè [17]. Yon diminisyon nan pwodiksyon sitokin enflamatwa kontribye nan rediksyon nan reyaksyon enflamatwa. Calcitriol se konnen siprime pwodiksyon an nan TNF-, interleukin-1 (IL{-1), interleukin{-2 (IL{-2), interferon-gamma (IFN-), ak lòt sitokin enflamatwa nan selil B ak T. Li kapab tou lage cytokin anti-enflamatwa tankou IL-4 ak IL{-10 [18] epi kontwole otofaji kont enfiltrasyon selil enflamatwa [19].

Pwopriyete antioksidan kalsitriol yo te rapòte nan depresyon, maladi fwa gra [20], maladi kadyovaskilè, ak lòt maladi ki gen rapò ak enflamasyon. Radikal gratis ak espès oksijèn reyaktif (ROS) akimile tou nan selil ak tisi pandan aje. Done pibliye yo te demontre ke estrès oksidatif afekte yon varyete de chemen siyal nan selil [21], ki gen ladan SIRT1, mitogen-aktive pwoteyin kinaz (MAPK), ak faktè nikleyè-κB (NF-κB). Jèn SIRT1 konsidere kòm yon jèn lonjevite ak represyon jèn sa a lakòz maladi ki gen rapò ak ekspresyon pwoteyin, sik selil, ak metabolis [22]. SIRT1-ΔExon8 se yon izofòm nouvo nan SIRT1, ki te egziste nan mamifè pa altènativman splicing. SIRT 1-ΔExon8 te konsidere tou kòm yon faktè ko-regilasyon nan tout longè SIRT1 [23].

Jiskaprezan, trè kèk etid konsantre sou efè aje ak senesans oksidatif sou selil NK. Efè kalsitriol sou SIRT 1-ΔExon8 pa te rapòte tou. Se poutèt sa, etid sa a vize pou mennen ankèt sou efè kalsitriol sou aje ak senesans oksidatif nan selil NK, paske selil sa yo okipe yon pozisyon santral nan sistèm iminitè natirèl imen an.

2. Materyèl ak metòd

2.1 Kilti selilè ak reyaktif

Twa echantiyon san periferik imen yo te akeri nan men donatè ki pa t gen okenn maladi otoiminitè aktif, maladi enflamatwa egi oswa kwonik, kansè, oswa lòt maladi ki gen rapò ak iminitè. Laj donatè yo te varye ant 48-65 ane. Selil mononikleyè san periferik (PBMC) yo te izole lè l sèvi avèk Lymphoprep Ficoll. Selil NK yo te elaji epi konsève lè l sèvi avèk yon Twous Kilti selil NK (MoreCell, Shenzhen, Lachin) nan 37 degre / 5 pousan CO2.

2.2 Flow cytometric analiz

Apre tretman ak kalsitriol pou 72 èdtan, selil NK yo te tache ak anti-moun FITC-CD3, PerCp-CD56, APC-CD16, PE-NKG2A, PE-TIM3, PE-PD1, ak PE-KIR (BioLegend, California, USA). Tout tès FACS yo te fèt lè l sèvi avèk DxFLEX Flow Cytometer (Beckman, Kalifòni, USA).

2.3 Mezi ekspansyon selilè, divilge cytokine ak tès sik selilè

Yo te detèmine ekspansyon selil yo lè l sèvi avèk yon Twous konte selil-8 [24] (CCK8; Beyotime, Shanghai, Lachin). Selil NK yo te trete ak kalsitriol pou 48 èdtan epi yo te kolekte supernatant la pou tès la bay Cytokine. Nivo sitokin yo te egzamine lè l sèvi avèk LEGEND Plex Human Inflammation Panel (BioLegend, Kalifòni, USA). Premyèman, pèl yo kaptire cytokine yo te enkube ak estanda yo oswa echantiyon ak Lè sa a, plis enkubasyon ak antikò deteksyon biotinylate. Solisyon antikò-obligatwa deteksyon biotinyl la, streptavidin (SA)-PE, te ajoute imedyatman pou bay siyal fliyoresan an [25]. Lè sa a, siyal sa yo te analize lè l sèvi avèk tès la FACS.

Sik selilè yo te mezire lè l sèvi avèk yon Twous deteksyon sik selil (Beyotime, Shanghai, Lachin). Selil NK yo te trete ak kalsitriol pou 72 èdtan. Selil sa yo te fikse nan 70 pousan etanòl frèt epi yo te kolore ak ribonukleaz A (RNase A) ak yodid propidium (PI) (Beyotime, Shanghai, Lachin) [26].

2.4 NK selil-touye tès

Selil erythroleukemic imen yo, selil K562 (ATCC, Virginia, USA), yo te enkube ak 10 uM 3, 3 -dioctadecyl-oxacarbocyanine (DIOBeyotime, Shanghai, Lachin) pou 15 minit epi yo te ajoute nan selil NK yo trete kalsitriol. nan diferan rapò (E/T'=1:1, 5:1 ak 10:1) pou 4 èdtan, respektivman (27).

2.5 Endiksyon senesans oksidatif ak analiz tach X-gal

Modèl in vitro NK selil aje lè l sèvi avèk oksijene idwojèn (H2O2). Yo nan lòd yo detèmine efè a anti-oksidasyon nan kalsitriol, selil NK yo te premye trete ak kalsitriol ak Lè sa a, ekspoze a 100 μM H2O2 pou 24 èdtan. Aktivite -galactosidase te mezire lè l sèvi avèk 5-bromo-4-kloro-3-indolil- -D-galactopyranoside (X-gal) tach. Selil trete yo te fikse nan 4 pousan paraformaldehyde epi yo tache ak solisyon tach galactosidase (Beyotime, Shanghai, Lachin) lannwit lan nan 37 degre [28]. Lè sa a, selil yo tache yo te sispann nan PBS ak imaj selil sa yo te akeri lè l sèvi avèk yon sistèm mikwoskòp Leica fluoresans. Twa imaj mikwoskopik yo te kolekte owaza nan diferan pozisyon nan 40 × agrandisman pou chak gwoup. Pousantaj selil X-gal-tache yo te kalkile epi itilize pou evalye aje selil yo lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ V.1.45S.

2.6 Tach ak analiz potansyèl manbràn mitokondriyo a

Chloromethyl-X-Rosamine (CMXRos) ak Hoechst (Beyotime, Shanghai, Lachin) te itilize pou evalye potansyèl manbràn mitokondriyo a. Nwayo selil yo (ble) yo te lokalize pa tach Hoechst, pandan y ap potansyèl manbràn mitokondriyo a te detèmine pa espesifik mitokondriyo ki endike lank fliyoresan, CMXRos. Hoechst plis CMXRos- selil yo (ki make pa flèch blan) te montre aktivite ki ba. Nivo fluoresans relatif la te kalkile lè w divize kantite selil Hoechst-pozitif pa selil CMXRos-pozitif [29]. Selil yo te enkube ak 200 nM CMXRos ak Hoechst (30 min, 37 degre) epi yo te detekte lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Leica Envèse nan longèdonn eksitasyon 579 nm ak 350 nm. Pousantaj Hoechst plis CMXRos plis selil yo te kalkile jan sa dekri nan Seksyon 2.5.

2.7 Western blotting

Selil yo te lysed lè l sèvi avèk radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis tanpon (Beyotime, Shanghai, Lachin) ak inibitè fosfataz PhosSTOP (Roche, Basel, Swis) ak 1 μM phenylmethylsulfonyl fliyò (PMSF) (Beyotime, Shanghai, Lachin). Pwoteyin total te quantifye lè l sèvi avèk Bradford Pwoteyin Assay Twous (TAKARA, Tokyo, Japon). Echantiyon pwoteyin yo te separe pa sodyòm dodecyl silfat-polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) epi transfere nan 0.22 μm polyvinylidene fliyò (PVDF) manbràn (Immobilon-P manbràn; Millipore, Massachusetts, USA). Apre bloke, manbràn yo te sonde ak antikò prensipal yo ak enkubasyon ak antikò segondè yo [30]. Manbràn yo te detekte lè l sèvi avèk sistèm nan Odyssey (LI-COR, Nebraska, USA).

2.8 Analiz estatistik

Done yo te analize pa yon sèl-fason analiz divèjans (ANOVA) lè l sèvi avèk GraphPad Prism epi prezante kòm mwayen ± devyasyon estanda (SD). 6846 W. LI ET AL. Yo te konsidere diferans ki genyen estatistik enpòtan nan P < 0.05. Rezilta yo te analize tou lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad la.

Mande plis:

Imèl:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plis 86 15292862950